实体瘤局部免疫治疗的探索与发展现状

刘娅 李龙浩 综述 邓红彬 审校

通常机体主要通过免疫监视、免疫识别、免疫反应等维持免疫稳态，其中任一环节不完整将破坏免疫稳定甚至造成免疫逃逸。免疫治疗通过增强肿瘤抗原的免疫原性、APC提呈抗原能力或者解除免疫抑制，从而调节免疫通路活性或改善肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME），解除机体免疫抑制状态，产生持久的抗肿瘤免疫应答能力。目前，免疫治疗以全身性的静脉用药为主，尽管能有效激活机体的抗肿瘤效应，但关于炎症分子风暴、毒血症及某些严重的免疫相关不良反应的报道并不少见，这些因素使得免疫治疗药物的使用浓度和剂量受限，致病灶局部血药浓度不足，免疫活性低下，产生免疫逃逸或耐药。因此，通过瘤内、引流淋巴结内直接给药或者引流淋巴结附近皮下给药的局部免疫治疗被探索实践。越来越多的证据显示，局部免疫治疗能改变TME和免疫环境，引发不同程度的全身免疫反应，具有良好的耐受性、安全性及疗效［1］。目前，临床局部免疫治疗主要有局部注射细胞因子、DC疫苗、肿瘤疫苗、溶瘤病毒、单克隆抗体、免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）及某些可溶性小分子等，本文将选取正在进行的极具前景的局部免疫治疗研究并对其进展进行综述。

1 局部免疫治疗的理论依据

免疫治疗作为一种新型治疗方式，目前主要是通过静脉给药，而大多免疫相关毒性与血药浓度相关，近年来报道的免疫相关严重不良反应发生率也较高，这无疑限制了免疫治疗的给药剂量和周期，使病灶局部药物浓度难以达到理想水平，导致治疗效果欠佳且容易产生耐药。另外，肿瘤具有异质性，同一机体不同部位肿瘤抗原存在差异，进展过程中也在不断产生新抗原，同时分泌基质以抵抗药物进入病灶局部发挥作用。因此，一种新的治疗形式产生，即局部免疫治疗，在针对肿瘤多克隆抗原产生特定抗体，提高免疫治疗疗效、减轻免疫相关不良反应、扩大免疫治疗获益人群等方面具有明显优势。首先，局部免疫治疗通过瘤内、淋巴结内甚至皮内直接给药，药物经淋巴引流到达原发灶和第三淋巴引流区（third drainage lymph nodes，TDLNs）内，不仅能以肿瘤本身作为抗原形成特异性“原位”疫苗促进肿瘤相关抗原（tumor associated antigens，TAAs）的释放，诱导抗肿瘤T 细胞应答，产生系统性、持续性抗肿瘤效应，将“冷肿瘤”变成“热肿瘤”［2］。更重要的是，能在病灶局部形成高血药浓度，而不带来明显的免疫相关不良反应，减少耐药和抵抗的产生，尤其有利于改善剂量限制性药物的使用［3］。联合化疗、放疗、ICIs等展现出了良好的安全性及有效性，其中局部免疫治疗联合ICIs 治疗已成为极具研究前景的治疗方式。相关小样本研究结果见表1。

表1 局部免疫治疗联合ICIs的小样本研究

2 局部免疫治疗的研究进展

2.1 Toll样受体（Toll like receptors，TLRs）激动剂

TLRs 是固有免疫的重要模式识别受体，通过胞外结构感知微生物、病毒产物的成分或产物，如细菌细胞壁成分或双链DNA等，诱导树突状细胞（dendritic cells，DCs）成熟和细胞因子分泌，促进先天性或适应性免疫应答。TLRs除了能表达在巨噬细胞、DC细胞等免疫细胞表面，诱导机体免疫应答，还能表达在肿瘤细胞表面，促进肿瘤生长。所以TLRs 的效应取决于机体的综合作用，但大多数TLRs 带来的是抗肿瘤效应［4］。TLR9 激动剂是富含C-G 的合成寡核苷酸，有B 型和C 型两种类型。PF-3512676 属于B 型TLR9 激动剂，主要激活B 细胞，系统性PF-3512676治疗联合化疗出现了较为严重的不良反应，且未改善临床结果［5］。而瘤内注射PF-3512676联合/不联合放疗在淋巴瘤或真菌样肉芽肿治疗中被证实安全且有效［6］。SD-101 属于C 型TLR9，能同时激活B 细胞和浆细胞样DC细胞。一项Ⅰb期早期临床试验证实瘤内注射SD-101 联合pembrolizumab 治疗晚期黑色素瘤患者，能显著提高肿瘤肿瘤客观缓解率（objective response rate，ORR）并诱导广泛肿瘤激活［7］。同样，瘤内注射SD-101 联合低剂量放疗及瘤内联合注射SD-101、CTLA-4抑制剂和OX40 mAb 等均被证实能诱发全身抗肿瘤免疫效应，根除转移性疾病，且不良反应可耐受，对伴有软脑膜转移的中枢神经系统性淋巴瘤也是有效的［8］。早期临床研究表明，瘤内注射TLR9激动剂联合PD-1抑制剂能进一步增强淋巴引流区T细胞浸润，逆转既往PD-1耐药，在注射与非注射部位均能产生持久的免疫效应［9］。

Imiquimod（R848）和resiquimod 均为美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗恶性黑色素瘤和鳞状细胞癌的TLR8激动剂，通过IFNa/β介导体内免疫反应，同时还能激活Bax 蛋白促进肿瘤细胞凋亡［10］。Imiquimod 是最早使用的TLR 激动剂，有临床试验报道，TLRs 激动剂的全身使用会导致较严重的不良反应，而局部imiquimod 治疗能有效控制局部皮肤黏膜黑色素瘤和乳腺癌皮肤复发，同时具有较低不良反应［11］。除了治疗表浅肿瘤，近来有实验证据表明，瘤内注入R848 治疗胰腺导管腺癌同样具有良好的抗肿瘤活性，该研究重点探索了R848 在治疗伴有恶病质情况的可行性［12］。另外，有早期临床研究表明局部Toll样受体激动剂联合PD-1/PD-L1阻滞剂能使PD-L1 表达上调，提示可能逆转PD-1 治疗后耐药［13］。

2.2 DCs疫苗的局部使用

DCs 是最专业的抗原提呈细胞（antigen presenting cells，APCs），交叉呈递肿瘤抗原，并与特异性T细胞结合，促进TH1分化，在诱导和维持抗肿瘤反应中发挥着关键作用，但同时新生DCs Fc 受体的表达也可以介导对肿瘤的保护作用［14］。所以，DCs在抗肿瘤免疫治疗中具有刺激和抑制双重作用，取决于其细胞亚群和成熟状态。尤其是CD103+DCs 亚群，是促免疫C-X-C 基序趋化因子（C-X-C motif chemokine 9，CXCL9）与CXCL10 的主要来源，其肿瘤灶内的表达、浸润与临床治疗结果相关［15］。DC 疫苗运用较早且安全性良好，Triozzi 等［16］在20 世纪初期证实了瘤内注射DC 疫苗可诱导有效的原位抗肿瘤活性。Yamanaka 等［17］通过比较皮内注射和瘤内、皮内同时注射自制DC疫苗的有效性后得出，瘤内和皮内同时注射能为Ⅳ级胶质瘤患者带来生存获益。然而，Bol等［18］的临床试验结果却显示淋巴结内DC 疫苗注入疗效低于系统性DC疫苗治疗，并且不良反应不可耐受。显然，药物联合方式与治疗结果密切相关，也可能是结内注药破坏了淋巴结结构。这些早期结果促进了DC细胞的临床研究。

2.3 以溶瘤病毒为主的局部免疫治疗

溶瘤病毒（oncolytic virus，OVs）是一类极具前景的新型抗肿瘤免疫治疗药物，由于病毒体积较大，可以根据需要编码多种基因，导入机体后能快速复制和溶解肿瘤细胞，持续性诱导特异性抗肿瘤免疫效应。而病毒的溶解特性以及宿主的抗疫苗免疫反应将阻止不受限制（和潜在的危险）的细胞因子的产生。OVs 一方面能直接溶解、破坏肿瘤细胞，另一方面，病毒在肿瘤细胞内增殖激活体内抗病毒系统，肿瘤坏死崩解后释放TAAs、损伤相关分子模式引发固有或适应性免疫反应［19］。

HF10 是一种自然突变型1 型人单纯疱疹病毒（human herpes simplex virus，HSV1），是一种未经基因修饰的OV。自瘤内注射HF10 治疗不可手术的胰腺癌患者被证实具有良好的安全有效性后，Hirooka等［20］设计了一项经内镜超声引导局部注射HF10 联合厄洛替尼和吉西他滨治疗局部晚期胰腺癌Ⅰ期临床研究，结果显示12 例患者的中位无进展生存期（median progression-free survival，mPFS）为6.3 个月，中位总生存（median overall survival，mOS）为15.5 个月，证实了在内镜超声（endoscopic ultrasonography，EUS）引导下，局部HF10联合药物治疗胰腺癌具有良好的安全性和明显的临床获益。而将HF10 改造为能表达GM-CSF 的mGM-CSF 扩增子并注入腹腔内，用于治疗伴有腹腔转移的卵巢癌小鼠模型，结果延长了小鼠OS，同时减少了腹腔播散风险［21］。目前，正在进行的有关临床试验包括HF10 联合nivolumab 作为可切除黑色素瘤的新辅助治疗的探索。

除了天然OVs，早在20世纪90年代，科学家们敲除腺病毒的E1B-55K基因，制成中国首个获批的、联合化疗治疗鼻咽癌的溶瘤病毒-H101。Xia等［22］报道了瘤内H101注射联合化疗对比单纯化疗治疗头颈部及食管鳞癌，有效率提高了1 倍，且相对安全。近年来，瘤内H101注射治疗肺癌或动脉化疗栓塞（TACE）联合H101灌注治疗晚期肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）均被报道可明显延长患者的OS［23］。目前，一项H101联合射频消融治疗HCC的临床试验正在进行。

Talimogene laherparepvec（T-VEC），是2015年至今FDA批准的第一个也是唯一一种可用于局部治疗复发、无法切除的皮肤、皮下或淋巴结转移的黑色素瘤，也是目前运用最广泛的溶瘤病毒。T-VEC 源于HSV-1，病毒内阻止MHC-I 类分子表达的基因被敲除（ICP34.5与ICP47），同时植入了编码GM-CSF的基因片段［24］。一项Ⅲ期随机开放试验（OPTIM）结果显示：相对于单纯皮下注射GM-CSF，瘤内T-VEC 注射有更高的持久应答率（endurance response rate，DRR）、完全缓解（complete remission，CR）（P＜0.001）和更长的mOS，这在未经治疗或分期较晚患者中尤其明显，不良反应可耐受［25］。早期临床试验已证实，与单一ipilimumab 治疗相比，T-VEC 联合ipilimumab更能有效提高ORR。瘤内注射T-VEC 联合静脉CTLA-4/PD-1 抑制剂被证实明显增加了IFN-γ、CD8+T细胞浸润，无论是在药物注射或非注射部位，均观察到较单一免疫治疗更持久、有效的抗肿瘤活性，且能逆转肿瘤对PD-1阻断剂的原发性耐药［26-27］。目前正在进行的有关瘤内T-VEC治疗联合ICBs或放化疗包括早期乳腺癌的新辅助治疗，晚期肉瘤、黑色素瘤治疗等。Pexa-Vec（JX-594）是能表达GM-CSF 的Wyeth牛痘疫苗，早期临床试验已展现出Pexa-Vec 全身使用的安全有效［28］。而局部JX-594治疗尚处于探索阶段，一项Ⅱ期临床试验比较了两个剂量水平［1×108/（Pfu）或1×109/（Pfu）］的瘤内Pexa-Vec 治疗晚期HCC疗效，结果显示肝内反应率无明显差异，但高剂量组OS 更长［29］。瘤内高剂量Pexa-Vec 治疗儿童恶性肿瘤也是安全的［28］。同样，瘤内Pexa-Vec 联合ICIs 也能重塑TME，逆转对ICIs 的耐药。目前，除肝内Pexa-Vec 注射联合sorafenibvs.单药索拉菲尼（sorafenib）治疗晚期HCC的开放、随机Ⅲ期临床研究（PHOCUS试验）正在进行。

2.4 单克隆抗体、免疫检查点抑制剂的局部应用

通常，CD8+T细胞能选择性地被主要组织相容性抗原复合体Ⅰ类分子激活，当DC细胞处理并提呈肿瘤抗原至引流淋巴结，即能诱导机体启动T细胞免疫反应。免疫逃逸的产生往往源于该途径启动的失败或通路失活。免疫治疗尤其是ICIs，通过特异性结合CTLA-4/PD-1受体，释放“免疫刹车”，诱导产生针对肿瘤多样性抗原的多克隆抗体，增加病灶局部甚至全身免疫活性细胞浸润。另一方面，TME 中具有多种免疫细胞，包括髓源性抑制细胞（myeloidsuppressor cells，MDSCs）、调节性T细胞（Tregs）、肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages，TAMs）、辅助性和效应性细胞毒性T 细胞（Th/Teff）、DCs 以及肿瘤分泌的免疫调节因子，ICIs 抑制免疫微环境，促进肿瘤局部甚至远处部位免疫细胞浸润，增强机体抗肿瘤免疫活性［30］。因此，包括CD40 mAbs、ICIs 在内的单克隆抗体旨在激活免疫反应、改善TME，调节免疫应答，从而增强机体抗肿瘤活性。

CD40 是TNF 家族受体成员，广泛表达于DC 细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、内皮细胞等表面，DC表面的CD40 能诱导T 细胞介导的抗肿瘤免疫反应。CD40 配体（CD154），主要表达在活化的T 细胞上，与CD40 结合后可上调细胞因子IL-12、黏附分子、共刺激分子和MHC 表达、增强APC 功能、激活T 细胞等。研究发现CD40的激活通路独立于固有免疫途径（如干扰素基因刺激因子STING 或TLRs 通路）［31］。静脉使用CD40 mAbs 具有良好临床疗效，但可能导致严重的不可耐受的细胞因子释放综合征和肝功能异常［32］。多项临床前试验已表明瘤内CD40 mAbs 治疗不但能减少不良反应，还具有良好疗效。当CD40 mAbs 联合TLR4 局部注射时，可恢复机体PD-1 细胞的敏感性，再联合ICIs 后，可改善DFS［33］。放疗联合瘤内CD40激动剂治疗则具有协同作用，并形成长久的免疫记忆［34］。

ICIs 包括CTLA-4、PD-1/PD-L1 抑制剂，作用于免疫细胞表面的CTLA-4或PD-1/PD-L1，系统性ICIs单药或者联合其他治疗在临床中已凸显疗效，但免疫相关不良反应与体内ICIs的浓度相关。研究表明，经肿瘤局部和静脉予以CTLA-4阻滞剂，达到相同疗效时，局部给药方式在血清中的药物浓度仅为全身给药的1/8，并能激活全身免疫反应，根除远处肿瘤，免疫相关不良反应明显降低［35］，并提示或许能有效逆转其他药物或治疗方式所致的免疫耐药。一项Ⅰ期临床试验结果显示，瘤内ipilimumab+IL-2 注射于晚期黑色素瘤治疗中在原发灶及转移灶中均体现出良好的耐受性及增强的免疫活性［36］。同样，局部CTLA-4 阻滞剂联合调节性Treg 细胞耗竭治疗晚期恶性肿瘤被证实能诱导荷瘤小鼠的永久免疫和肿瘤的永久消退［37］。而联合放疗则能够逆转免疫原性差的转移性乳腺癌小鼠对单一免疫治疗的耐药，降低转移风险，延长生存［38］。

2.5 可溶性小分子的局部使用

绝大多数药物或制剂都能直接参与或者诱导机体免疫反应，而PV-10（provectus biopharmaceuticals）则通过间接方式诱发有效免疫反应。PV-10是一种病灶内的注射可溶性二钠盐，PV-10能选择性聚集于转化细胞的溶酶体内并将其裂解，激活机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应［39］。PV-10早已被FDA 批准为治疗转移性黑色素瘤及HCC 的用药，并在多项早期局部治疗及联合放疗、免疫检查点抑制剂治疗中证实安全性及耐受性好［40］。尽管一项比较PV-10、化疗和溶瘤病毒在局部晚期黑色素瘤疗效的Ⅲ期临床试验因入组人数不足而提前终止，但另一项PV-10 联合化疗治疗肝癌的Ⅰ期临床试验正在展开。

3 局部免疫治疗联合其他治疗

3.1 联合放疗

放疗主要用于早期肿瘤的辅助治疗以及晚期无法根治肿瘤的姑息减症治疗，一方面通过电离辐射直接或间接作用消灭肿瘤，另一方面，破坏的肿瘤细胞可释放自身抗原，形成原位肿瘤疫苗，使“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”，诱发局部甚至全身免疫反应。然而，放疗本身具有建立与破坏免疫反应的双重作用，放疗的最终效应取决于辐射总剂量、排序、单次剂量及分割方案。此外，某些体积较大的肿瘤对放疗具有抵抗性。证据表明，放疗联合全身免疫治疗能增加TAAs数量、增强APCs交叉提呈抗原能力和T细胞激活，诱导趋化因子CXC 模体CXCL9、CXCL10、CXCL11 表达等，促进T 细胞向肿瘤灶及引流淋巴结迁移，逆转TME 的免疫抑制，控制局部肿瘤生长，同时也能清除远处转移部位肿瘤，即远隔效应［41］，但这种联合治疗方式导致严重不良反应的案例并不少见。临床前实验或早期临床试验数据均显示，放疗联合局部免疫治疗打破了全身治疗带来的剂量限制性毒性，同时改善生存［42］。尽管这样，真实世界中能从免疫治疗获益的人群仅为少数，那么，如何筛选合适的患者，如何将不同的免疫治疗方式与放疗相结合，以及如何根据患者自身动态变化选择并调整最佳的放疗及免疫治疗的时机、剂量和靶区，最大限度地提高放疗与免疫治疗的协同作用成为焦点问题。近来，Grassberger等［43］结合现有临床数据，开发了一种预测免疫治疗和放疗相互作用的建模方法，并强调其如何与抗肿瘤免疫的生物标记物相结合来优化放疗方案，尚待大规模实验数据进一步验证。

3.2 联合光治疗

光治疗主要是指光动力治疗（photodynamics therapy，PDT）和 光 热 治 疗（photothermal therapy，PTT）。PDT 涉及可见光及光敏感剂，可见光激活光敏剂后，诱导产生活性氧，从而利用光毒性将肿瘤细胞毁灭。PTT则是在光激发下，利用光热剂将光能转化为热能，诱导癌细胞的热消融。PDT和PTT均显示出具有选择性的局部治疗优势，不对周围组织造成破坏，因此成为临床上代替放化疗及手术治疗SCC的不二选择。但由于光线穿透性差或局部光毒性不足，单一方式治疗肿瘤复发率高。两者联合治疗可提高治疗疗效［44］。原位光免疫治疗（in situphotoimmunotherapy，ISPI）是结合局部选择性PTT 和免疫佐剂的免疫疗法，光热疗法使病灶局部温度升高、释放DAMPs 及肿瘤相关抗原、诱导热休克蛋白和肿瘤细胞破坏，产生杀伤肿瘤和刺激抗肿瘤免疫反应的协同作用。激光免疫治疗属于ISPI 之一，在鳞状细胞癌、乳腺癌、黑色素瘤的治疗中展现出治疗潜力［45］。

4 结语

随着对肿瘤发生及免疫治疗耐药机制的了解，精准治疗已成为肿瘤治疗的终极目标。人体免疫系统错综复杂，参与激活、调节、应答的免疫通路更是数不胜数，关键环节是免疫系统的正常激活，而多种相互依赖的免疫刺激途径的联合治疗可能更具希望。全身免疫治疗确实取得了优良的疗效，相比而言，局部免疫治疗在无需全身暴露的情况下尽量形成病灶局部集中的免疫调节，减少了不良反应而不影响临床疗效。更重要的是，通过局部免疫调节诱导全身效应，根除播散性疾病，并产生永久性免疫记忆。尽管局部免疫治疗大多仍处于实验性探索阶段，在临床转化中也面临不少问题。1）动物模型（大多是小鼠模型）与人体存在巨大差异，特别是免疫调剂方面，实验转化为实践可能出现相差甚大甚至相反的结果。2）局部免疫治疗的用药剂量、用药方案的确定仍需更多、更大规模的研究，特别是在联合治疗方面，联合治疗的最佳获益模式有待进一步探索。目前已有相关试验在探索局部免疫治疗在早期肿瘤新辅助治疗中的地位，但需要更多更有力的证据。3）局部免疫治疗对于表浅肿瘤的治疗和观察相对容易实现，深部肿瘤甚至内脏的治疗需借助影像学工具、生物材料甚至基因工具等，或许需进一步优化设计才可能实现成功转化。但是，从现有的临床结果推测，局部免疫治疗是值得探索的实现精准治疗新途径。