基于网络药理学探讨乌梅丸治疗糖尿病肠病的作用机制

许宗颖，张冬梅，陆瑞敏，张 迪，舒 展，陈 萌

（1. 北京中医药大学中医学院，北京100029；2. 北京中医药大学东直门医院，北京100700；3. 北京中医药大学中药学院，北京

100029）

糖尿病肠病（DE）是糖尿病的常见并发症之一，临床发病率约为10%～20%［1］。其临床表现为间歇性水样泻或脂肪泻，有时便秘和腹泻交替出现，或可表现为顽固性水样泻［2］，不仅影响患者生活质量，也影响药物的治疗效果，造成了巨大的社会负担。研究显示，DE 的发生与植物神经病变、肠电生理紊乱、小肠通过时间延缓、菌群及肠道激素分泌变化失调有关［3］。现代医学主要采取保守治疗，除控制饮食和纠正血糖以外，应用地衣芽孢杆菌活菌颗粒等益生菌制剂纠正肠道菌群紊乱［4］，甲钴胺缓解神经病变［5］。但针对糖尿病腹泻患者，仅应用药物存在无法有效改善胃肠消化道运动受限、胃肠激素失调等问题。

中医学虽无DE 之名，但按照临床表现可将其归属于“泄泻”范畴。乌梅丸（WMW）由乌梅、细辛、干姜、黄连、附子、当归、蜀椒、桂枝、人参、黄柏十味药物构成，是《伤寒论》主治“久利”常用方。全方具有酸苦辛甘并进，寒热并用，邪正兼顾的特点，临床治疗多疾病导致的慢性腹泻疗效显著［6，7］，但其治疗DE 作用机制尚不明确。因此，本研究拟通过运用网络药理学方法，探讨乌梅丸治疗糖尿病肠病的潜在分子机制，为深入开展乌梅丸治疗DE 及其临床合理应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 乌梅丸活性成分的筛选

检索中药系统药理学分析平台［8］（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18 为筛选条件，以乌梅、细辛、干姜、黄连、附子、当归、花椒、桂枝、党参［9］、黄柏为关键词分别进行检索，筛选乌梅丸中各药的活性成分。其中，OB 是指药物经口服给药后被机体吸收进入血液循环的相对量和速率；DL反映化合物中的特定功能基团与已知药物的相似性，二者对中药化学成分活性的评估具有重要意义。

1.2 靶点筛选及药物‐化合物‐靶点网络的构建

使 用PubChem Search 数 据 库［10］（https：//pub‐chem.ncbi.nlm.nih.gov/search/）查询活性成分的Canonical SMILES 字符串（Simplified molecular in‐put line entry specification，SMILES）。采 用Swis‐sTargetPrediction［11］（http：//www. swisstargetpre‐diction.ch/）数据库间接预测化学成分作用靶点。输入化学成分的Canonical SMILES 字符串，将条件设定为“Homo sapiens”，进行靶点对接。分别按Swis‐sTargetPrediction P≥0.05 进行筛选，去除重复选项，建立乌梅丸潜在靶点数据库。

将药物、活性成分、潜在靶点导入Cytoscape 3.7.2［12］软件，构建乌梅丸‐活性成分‐作用靶点结构网络图，并进行可视化分析处理。运用Network Analyzer 工具进行拓扑分析。

1.3 乌梅丸‐DE‐靶点网络的构建

以“diabetes enteropathy”（糖尿病肠病）为关键词，通 过Gene Cards 数 据 库［13］（https：//www.gene‐cards.org/），TTD［14］（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/），DisGeNET 数 据库［15］（https：//www.disgen‐et.org/）获得DE 疾病靶点。将乌梅丸的潜在靶点与DE 的靶点进行匹配，运用Venny 2.1［16］（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）绘 制韦恩图，运用Cytoscape 3.7.2 构建乌梅丸‐DE‐靶点可视化网络。

1.4 乌梅丸治疗DE 的蛋白质互作网络的构建

将匹配得到的乌梅丸治疗DE 的靶点蛋白以gene symbol 的 形 式 上 传 到 String 数 据 库［15］（https：//string‐db.org/）进行蛋白质‐蛋白质的相互作用分析，设置物种为“Homo sapiens”（人），置信度得分大于等于0.4，获得最终的蛋白质相互作用网络图（PPI）。

1.5 GO 富集分析和KEGG 富集分析

运 用omicshare（http：//www.omicshare.com/tools）对交集靶点基因进行基因本体（GO）生物过程以及基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路分析，以P‐value≤0.05 为筛选标准，得到乌梅丸治疗DE 的潜在生物途径和信号通路。

1.6 分子对接验证

将筛选得到的核心靶点与其对应的活性成分进行分子对接，根据‐CDOCKER ENERGY 对乌梅丸中活性成分与关键靶点结合程度进行评价。从PBD 数据库（https：//www.rcsb.org/）中下载蛋白的三维结构，在TCMSP 数据库中下载对应成分的三维结构，在受体和配体结构导入Discovery Studio 2016 软件，选择CDOCKER（CHARMm 力场）进行对接。

2 结果

2.1 乌梅丸中活性成分的筛选

通过TCMSP 共获得乌梅丸活性成分909 个（不含重复值），其中40 个来自乌梅，192 个来自细辛，148 个来自干姜，48 个来自黄连，65 个来自附子，125 个 来 自 当 归，101 个 来 自 花 椒，220 个 来 自 桂 枝，134 个来自党参，140 个来自黄柏。经OB≥30%，DL≥0.18 筛选，共筛选出乌梅丸活性成分108 个（不含重复值），其中乌梅8 个，细辛8 个，干姜5 个，黄连14 个，附子21 个，当归2 个，花椒5 个，桂枝7个，党参21 个，黄柏37 个。见表1。

表1 乌梅丸活性化合物基本信息Tab 1 Basic information of active compounds of fructus mune

续表

2.2 乌梅丸‐成分‐靶点网络的构建与分析

运用cytoscape 3.7.2 构建乌梅丸‐成分‐靶点网络。该网络一共有252 个节点，包括，10 个药物节点，103 个活性成分节点，139 个潜在靶点节点，共784 条边。网络中紫色椭圆形表示药物，黄色椭圆形表示活性成分，红色长方形表示靶点。网络中的每条边表示代表药物所含有的活性化合物以及活性化合物与靶点基因之间的相互作用关系。节点的度值表示在网络中该节点与其他节点的连接数目，借 助Cytoscape 3.7.2 软 件 中 的“Network ana‐lyze”功能对网络进行拓扑属性分析。其中，degree值排名前5 的关键化学成分为槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、β‐谷甾醇（beta‐sitosterol）、木犀草素（luteolin）、豆甾醇（Stigmasterol），对应的de‐gree 值分别是364、86、42、41、25。Degree 值排名前5 的靶点有芳香化酶（CYP19A1）、乙酰胆碱酯酶（ACHE）、细胞周期蛋白依赖激酶1（CDK1）、细胞色素P450 1B1（CYP1B1）、多重药耐药蛋白1（ABCC1），它们的degree 值分别是19、13、11、9、9。 见图1。

图1 乌梅丸‐成分‐潜在靶点网络图Fig 1 Compound and potential targets network of fructus mune

2.3 乌梅丸‐DE‐靶点网络的构建与分析

将139 个乌梅丸潜在靶点和714 个DE 靶点取交集，共得到24 个靶点，见图2。通过Cytoscape 3.7.2 软件，构建乌梅丸‐成分‐DE‐靶点的可视化网络图，见图3。该网络共有34 个节点，99 条边。图中不同颜色和形状的节点代表的信息不同，其中蓝色椭圆形节点代表共有靶点，粉色三角形节点代表有效成分，绿色菱形代表药物乌梅丸，红色八边形代表疾病DE。最终得到乌梅丸治疗DE 的关键化学成分共8 个，分别是槲皮素、山奈酚、木犀草素、吴茱萸次碱（rutaecarpin）、氧麦角甾醇（oxyergoster‐ol）、芝麻素（sesamin）、细辛脂素（asaricin）、11，14‐二十碳二烯酸（11，14‐eicosaenoic acid），degree 值分别是34，16，14，4，2，2，2，2。乌梅丸‐DE 的共同基因靶点排名前十的为MMP9、SYK、ABCB1、ALOX5、CA2、XDH、MCL1、ALK、GPR35、PTGS2。 见表2。

图2 乌梅丸与DE 的靶点韦恩图Fig 2 Venn diagram of Wumei Wan and diabetes enter⁃opathy

图3 乌梅丸‐成分‐DE‐靶点网络图Fig 3 Compound，diabetes enteropathy and targets net⁃work of Wumei Wan

2.4 PPI 网络的构建

排除一个游离靶点蛋白，将23 个匹配靶点在STRING构建PPI网络。该PPI网络共有23个节点，71条边，其中评分≥0.97 的互作蛋白为AKT1‐PIK3R1、AKT1‐SRC、ALXO5‐PTGS1、ALXO5‐PTGS2、IGF1R‐PIK3R1 、MMP9‐SRC 、NOS2‐SRC 、PIK3R1‐SRC，见图4。通过分子复合物检测算法（MCODE）进一步分析PPI结果，AKT1、MMP9、SRC、PTGS2、PPARG、NOS2、AHR为乌梅丸治疗DE的核心蛋白靶点，见图5。

表2 乌梅丸治疗DE 的潜在靶点Fig 2 Protential targets of Wumei Wan treating diabetes enteropathy

图4 乌梅丸‐DE 蛋白互作网络Fig 4 Wumei Wan and diabetes enteropathy PPIs net⁃work

2.5 乌梅丸治疗DE 靶点的GO 和KEGG 分析结果

图5 乌梅丸‐DE PPI 核心靶点网络Fig 5 Wumei Wan and diabetes enteropathy PPI core tar⁃gets network

GO 富集分析结果显示共获得61 条生物过程。排名前10 的生物学过程包括不饱和脂肪酸代谢过程（unsaturated fatty acid metabolic pro‐cess）、类花生酸代谢过程（icosanoid metabolic process）、酶联受体蛋白信号通路（enzyme linked receptor protein signaling pathway）、蛋 白 质氨基酸磷酸化（protein amino acid phosphoryla‐tion）、细胞对胰岛素刺激的反应（cellular re‐sponse to insulin stimulus）、磷 酸 化（phosphoryla‐tion）、类花生酸合成过程（icosanoid biosynthetic process）、不饱和脂肪酸生物合成过程（unsatu‐rated fatty acid biosynthetic process）、跨 膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路（transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway）。 预 测乌梅丸可能通过调节脂肪酸合成代谢过程和配体受体结合过程干预DE，见图6。

KEGG 通路富集分析结果显示乌梅丸治疗DE 的通路共有72 条，主要涉及松弛素信号通路（Relaxin signaling pathway）、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂抵抗（EGFR tyrosine ki‐nase inhibitor resistance）、C 型 凝 集 素 受 体（CLRs）信 号 通 路（c‐type lectin receptor signaling pathway）、内分泌抵抗（endocrine resistance）、脂肪细胞脂解调节（regulation of lipolysis in adipo‐cyte）、血管内皮生长因子信号通路（VEGF sig‐naling pathway）、血小板活化（platelet activation）、肿瘤通路（pathways in cancer）等，见图7、8。

图6 GO 功能分析气泡图Fig 6 Bubble diagram of Go Function analysis

2.6 分子对接验证

通过上述结果，通过CDOCKER 模块将AKT1，MMP‐9，SRC，PTGS2，PPARG，NOS2，AHR 与关键活性成分山奈酚、木犀草素、槲皮素、吴茱萸次碱、11，14‐二十碳二烯酸进行分子对接。将对接结果‐CDOCKER ENERGY 进行均一化处理，‐CDOCKER ENERGY 值 越 高，说 明 分 子 与 蛋白受体对接越稳定，对接结果越可靠。结果显示槲皮素、山奈酚、木犀草素与AKT1，MMP‐9，SRC，AHR，PTGS2，PPARG，NOS2 具有较好的结合作用，11，14‐二十碳二烯酸、吴茱萸次碱与MMP9，SRC，PTGS2，PPARG 具有较好的结合作用。对接结果与网络药理学结果一致，见图9。

图7 KEGG 通路分析气泡图Fig 7 Bubble diagram of KEGG pathway analysis

图8 KEGG 通路图Fig 8 KEGG pathway

图9 分子对接结果Fig 9 Molecular docking results

3 讨论

DE 的发生主要与长期存在的炎症和氧化应激有关，糖尿病引起的胃肠壁结构重构，神经元数量结构改变和神经内分泌肽分泌减少，肠道微血管障碍是引发DE 的主要因素［17］。陈萌教授认为糖尿病中有一类患者为长期过食肥甘厚味，积热内蕴，化燥伤津，发为消谷。即《素问·奇病论》［18］云“肥者令人内热，甘者令人中满，故其气上溢，转为消渴。”消渴日久，湿热壅滞，脾胃受损，脾阳不足，清浊不分，大肠传导失司，遂见泄泻。乌梅丸中乌梅酸涩性平，滋阴养血，兼能敛肺涩肠，黄连、黄柏味苦性寒，是经方中常用的清热燥湿药，尤其适用于胃肠湿热所致的恶心、呕吐、痞满、泻利等症，干姜、附子、桂枝、细辛、蜀椒味辛性温热，散寒止痛，党参、当归味甘性平微温，健脾养肝，气血双补，十味药合用，辛散酸收、苦泄甘补，针对DE 寒热错杂、虚实夹杂的病机尤为适用。研究表明乌梅丸能够溃疡性结肠炎、腹泻型肠易激综合征、肠息肉、糖尿病胃轻瘫等多种胃肠道疾病，乌梅丸能够降低糖尿病大鼠IL‐10、TNF‐ɑ 等炎症因子水平、降低血糖水平，改善胰岛素抵抗和调节肠道菌群［19，20］。因此，运用乌梅丸治疗DE 有坚实的理论和临床实践基础。

通过分析乌梅丸‐成分‐DE‐靶点网络发现，方中的关键化合物为山奈酚、木犀草素、槲皮素、氧麦角甾醇、芝麻素、细辛脂素、吴茱萸次碱、11，14‐二十碳二烯酸等。研究显示，山奈酚具有抗氧化、抗癌、抗炎等多种治疗作用［21］，口服山奈酚能够降低NOS 和PGE‐2 水平，抑制结肠黏膜MPO 活性，降低炎症因子TNF‐α、IL‐1β、IL‐6 和ICAM‐1 过度分泌，负调控TLR4、NF‐κB 和STAT 炎症信号通路，进而减轻肠道炎症损伤［22］。木犀草素具有很强的清除自由基的功能，能够通过激活Nrf2/ARE 信号通路，发挥抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用［23］，同时能抑制结肠平滑肌运动和Ca2+电流，具有一定的止泻作用［24］。槲皮素作为糖尿病营养补充剂，一方面能够抑制肠内葡萄糖吸收、刺激胰岛素分泌，以及改善外周组织对葡萄糖的利用［25］，另一方面能够调节Cl−通道和肠道通透性，改善腹泻状态［26］，同时可通过抗炎作用改善肠道微血管细胞黏附和生长，进而调节肠道微血管障碍［27］。氧麦角甾醇能够通过Fas/Fasl 和Bcl2/Bax 调控细胞凋亡［28］。芝麻素具有良好的神经元保护作用，可以降低血糖水平，改善神经元活动状态，修复神经元损伤和抑制细胞凋亡［29］；细辛脂素具有显著的镇痛作用［30］；吴茱萸次碱具有强血管活性，可能通过抑制缺血相关损伤，维持正常的脂质和葡萄糖代谢影响DE［31］。因此，推测以上关键化合物能够在乌梅丸治疗DE 过程中发挥抗炎、抗氧化应激、调节血糖水平、改善神经元活性和肠道微血管障碍的作用。

高血糖介导的氧化应激和炎症反应是DE 的重要病理损伤机制。本课题通过分析PPI 核心网络结果，乌梅丸治疗DE 的关键靶点为AKT1、MMP9、SRC、PPARG、NOS2、AHR 等。NOS2 是NOS 的一个亚型，能够催化大量NO 产生，NO 和过氧亚硝酸盐的增加导致细胞结构的氧化损伤［32］。过氧物酶体扩散者激活受体γ（PPARγ）是核受体家族一员，调节多种的信号包括代谢、炎症和氧化应激通路，肠道内PPARγ 的低表达可能导致炎症的发生，部分炎症因子如TNF‐α 高表达能够抑制PPARγ 表达［33，34］。MMP9 参与细胞外基质的降解，细胞外基质成分合成与降解的变化在组织修复和炎症创口愈合方面起着非常重要的作用，研究表明MMP9 可以通过血管生成促进糖尿病视网膜微血管病变［35］。AHR 是一种配体激活的转录因子，其不仅可以作为各种环境毒素的受体介导毒性反应，还可以在免疫系统中发挥很重要的功能，AHR 能够负向调控IL‐17 介导的炎症相关因子的产生而缓解肠道炎症［36］。SRC 是一种与膜结合的非受体酪氨酸激酶，活化的SRC 在细胞连接处拆卸细胞与细胞之间的粘附发挥重要的作用，研究表明SRC 和肠道粘膜损伤 正 相 关，SRC 能 促 进TNF‐ɑ 刺 激EGF 超 激 活，SRC 过 表 达 与 肠 癌 的 进 展 有 关［37］。 AKT1 是mTORC1 的亚基，通过磷酸化与14‐3‐3 蛋白结合的方式负调控mTOR 活性，在神经生长因子介导的神经保护中起作用［38］。乌梅丸可能通过调节上述关键靶点表达介导抗炎抗氧化应激及神经保护作用进而对DE 产生了一定的治疗作用。

利用Omicshare 平台对乌梅丸和DE 的交集靶点进行KEGG 通路分析，结果表明，乌梅丸治疗DE的核心通路主要涉及松弛素信号通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药、CLRs 信号通路、VEGF 信号通路等信号通路。CLRs 作为树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等细胞的模式识别受体（PRRs），在配体结合后，CLRs 刺激细胞内信号级联，诱导炎症细胞因子和趋化因子的产生，触发对病原体的先天和适应性免疫［39］，研究证实CLRs 能够识别晚期糖基化终末产物［40］，在DE 的肠道微生物黏膜免疫平衡和肠道神经血管病变中发挥关键作用。EGFR 酪氨酸激酶抑制剂抵抗信号通路中介导细胞凋亡，与肠壁结构重构可能存在关联。EGFR 是一种参与细胞内稳态调节的酪氨酸激酶，高血糖可以诱导EGFR 和AKT 磷酸化，增加ROS 水平，最终可能导致器官结构重构，包括组织紊乱、细胞凋亡和纤维化［41］，研究发现糖尿病刺激EGFR、胰岛素样生长因子（IG‐FR），激活AKT 导致心脏细胞重构［42］，EGFR 酪氨酸激酶抑制剂抵抗信号通路也可能通过同样模式引发胃肠壁结构重构，导致DE 发生。松弛素信号通路参与减缓和延迟糖尿病并发症。松弛素与胰岛素为同源激素超家族，对心脏、血管和结缔组织内的细胞外基质有重要的影响。研究发现外源性松弛素可以改善糖尿病患者胰岛素敏感性［43］，促进动脉和微血管扩张，从而增加器官灌注，对抗缺血性损伤，改善血管的不良重构，促进细胞外基质的翻转，从而发挥抗纤维化作用［44］。松弛素信号通路对DE 病理改变具有多重作用，在DE 中的作用值得进一步研究。VEGF 信号通路在血管生成和发展过程中至关重要，与肠道微循环密切相关。VEGF能够增加血管通透性，增加血管内皮迁移、增殖和血管形成［45］。VEGF 与VEGFR‐2 的结合导致不同信号传导途径的级联，如PI3K‐Akt 信号通路、P38 MARK 信号通路、Ca2+信号通路等，并介导的内皮细胞增殖和迁移，促进其内皮细胞存活和血管通透性。COX2 间接作用于PGI2，PGI2 具有扩血管和抗血小板聚积作用，能够通过PPAR/14‐3‐3 途径保护内皮细胞存活并减少血管平滑肌细胞凋亡［46］。综上，本研究富集到的KEGG 通路与DE 存在一定关系，乌梅丸可能通过调节肠道免疫平衡，抑制胃肠壁结构重构，改善肠道微血管障碍等治疗DE。

本研究采用网络药理学的方法，系统阐述了乌梅丸治疗DE 的作用机制，发现乌梅丸治疗DE 的主要成分是山奈酚、木犀草素、槲皮素、氧麦角甾醇、芝麻素、细辛脂素、吴茱萸次碱等，其核心基因是AKT1，MMP9，SRC，PPARG，NOS2 等，通过参与不饱和脂肪酸代谢过程、类花生酸代谢过程、酶联受体蛋白信号通路、蛋白质氨基酸磷酸化、细胞对胰岛素刺激的反应等脂肪酸合成代谢过程和配体受体结合相关的生物过程，通过松弛素信号、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、CLRs 信号通路等通路调节肠道免疫平衡，抑制胃肠壁结构重构，改善肠道微血管障碍，从而发挥治疗的作用。这为进一步研究乌梅丸治疗DE 的作用机制提供了线索和理论依据，但本研究仍存在诸多局限性，在今后的研究中，可以通过动物模型，从DE 胃肠壁结构重构和肠道微血管障碍角度对网络药理学技术筛选出的关键靶点和通路进行进一步验证。