芪参益气滴丸对急性心梗大鼠α7nAChR抗炎通路的影响

严孝花，卫 国

AMI因发病率高、预后差，严重威胁我国人民的健康[1]。AMI作为世界范围内主要的死亡原因[2]，目前在我国死亡率总体呈上升态势并且趋于年轻化趋势，2016年AMI死亡率城市为58.69/10万，农村为74.72/10万[3]。尽管目前随着医疗技术的进步，AMI的住院病死率降低了，但AMI后心力衰竭、心率失常及猝死等再发急性心血管疾病的风险仍非常高，因此AMI防治任务仍非常艰巨。

中医医学很早就有关于AMI方面的认识和治疗方法，并且中医药在防治心血管疾病方面具有自己的临床优势[4-5]。随着现代中药医学的发展，越来越多的现代中药制剂被应用于临床，芪参益气滴丸作为一款现代中药制剂，目前广泛应用于治疗心血管疾病，能显著改善AMI患者的预后[6]。尽管目前芪参益气滴丸在AMI防治方面效果显著，多个研究也从不同的研究方向对其作用机制进行了探讨，但其作用机制仍不是十分清楚。本研究通过建立大鼠AMI模型，应用芪参益气滴丸予以治疗后，观察其对AMI大鼠α7nAChR抗炎通路的影响，来探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 无特定病原体（SPF）级SD健康成年雄性大鼠,体重(280±20)g购自西安交通大学动物实验中心(批号：20181113)。IL-6、α7nAChR、NFκB p50、NF-κB p65抗体及RNA提取试剂盒（英国，Abcam）；TakaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0试剂盒（大连TakaRa）；TUNEL检测试剂盒（北京鼎国）；HE染色试剂盒及Masson染色试剂盒（上海江莱生物）；IL-6，TNF-α、NF-κB p50和NF-κB p65的TaqMan探针，由安诺伦（北京）生物科技有限公司代理设计。BIO-RAD电泳、转膜系统、ChemiDoc TM XRS+胶成像仪器（美国BIO-RAD公司），Nikon Tis型荧光显微镜及配套分析软件NIS-Elements Software BR（日本尼康公司），Vevo2100小型动物超声仪（加拿大Visual Sonics公司）。芪参益气滴丸购于天士力制药集团股份有限公司(批号：国药准字Z20030139，规格为0.5 g/袋)。

1.2 动物模型制备及分组 选用45只成年雄性SD大鼠，随机分为假手术组，模型组及治疗组，每组15只。模型组及治疗组采用结扎左冠状动脉前降支建立AMI动物模型，按文献报道的造模方法建立动物模型[7]，假手术组仅手术不结扎血管左冠状动脉前降支，余步骤同前。术后第2 d，治疗组灌芪参益气滴丸40 mg/(kg.d)，假手术组及模型组给予灌4 ml/(kg.d)等量重量盐水，连用28 d。各组在第28 d结束后，戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉，先行超声心动图检查，而后腹主动脉穿刺抽血及摘取心脏，处死大鼠。

1.3 检测指标

1.3.1 超声心动图检测心脏结构及心功能 按文献报道的超声心动图检测方法进行检测[8]。

1.3.2 心肌组织病理学观察 取处死大鼠心脏，沿左心室长轴中段横断面切片，制作4μm厚石蜡切片，分别HE染色及Masson染色，在光镜下观察分析心肌组织形态学变化情况。

1.3.3 TUNEL染色检测心肌细胞的凋亡 取以上各组制备的石蜡切片，按照TUNEL染色试剂盒提供的方法步骤染色，DAPI细胞核复染。荧光显微镜下观察，每张玻片选10个非重复视野，计数阳性细胞个数。

1.3.4 酶联免疫吸附试验法检测血清IL-6及TNF-α的表达 腹主动脉采血后，3000 r/min离心15 min，取血清，艾本德(Eppendof)管分装冻存于-80℃冰箱备检。采用ELISA法按试剂盒说明书要求进行检测大鼠血清中IL-6及TNF-α的水平。

1.3.5 蛋白印迹法检测心肌组织中IL-6、TNF-α、α7nAChR、NF-κB p50及NF-κB p65蛋白的表达取0.2 g心尖部心肌组织，提取心肌蛋白，经定量、上样、电泳、转膜、一抗及二抗封闭、发光，显影条带图像扫描，应用Scion Image软件测量分析。

1.3.6 实时定量PCR（qPCR）检测IL-6、TNF-α、α7nAChR、NF-κB p50及NF-κB p65 mRNA的表达

根据RNA提取试剂盒操作说明进行操作，TaqMan探针，引物设计及PCR条件（表1）。提取心肌组织总RNA，用RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0试剂盒逆转录为cDNA。PCR条件：94℃，4 min，55℃，30 s，60℃，30 s，40个循环，凝胶成像系统摄像扫描并分析。

表1 实时定量(PCR）引物设计及条件

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件分析数据，计量资料以−s表示，多组间均数比较采用one-wayANOV分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠的生存情况比较 造模成功后，观察各组大鼠的病死率情况，假手术组，病死率为13.3%，模型组与治疗两组大鼠存活率无明显差异（图1）。

图1 各组大鼠生存情况

2.2 各组大鼠心脏结构及心功能比较 28 d后各组大鼠行超声心电图检查提示，模型组与治疗组整体大鼠左室扩大，心脏收缩功能降低，与假手术组比较有明显差异(P＜0.05)。治疗组与模型组比较，治疗组大鼠LVDd、LVDs均显著降低（P＜0.05），LVEF显著提高（P＜0.05）,见表2。

表2 各组大鼠心脏结构和心功能比较(−s)

表2 各组大鼠心脏结构和心功能比较(−s)

注:与假手术组比较,①P ＜ 0.05； 与模型组比较,②P ＜0.05

组别 LVDd（mm） LVDs（mm） LVEF（%）假手术组 5.78±0.73� 2.73±0.79� 80.35±3.53�模型组 7.15±1.68�� 5.82±1.57�� 42.26±13.74�治疗组 6.46±1.49���� 3.90±1.38���� 61.49±16.28����

2.3 各组大鼠心肌组织病理学观察 HE染色及Masson染色显示假手术组大鼠心肌组织结构基本正常，模型组大鼠心肌组织结构不规则，模糊，肌纤维坏死、断裂、萎缩、排列不整齐，巨噬细胞等大量炎性细胞浸润，心肌间纤维组织增生明显；治疗组大鼠心肌组织结构基本规则，肌纤维坏死、萎缩及断裂较少，排列较整齐，有少量的巨噬细胞等炎性细胞浸润，心肌间纤维组织增生不明显。

2.4 各组大鼠心肌细胞凋亡指数比较 与假手术组比较，模型组及治疗组心肌细胞凋亡指数显著增加（P＜0.05）；模型组与治疗组比较，治疗组大鼠心肌细胞凋亡指数明显降低（P＜0.05），见表3。

2.5 各组大鼠血清中IL-6及TNF-α的表达比较

与假手术组比较，模型组及治疗组血清中IL-6及TNF-α的表达明显增加（P＜0.05）；模型组与治疗组比较，治疗组大鼠血清中IL-6及TNF-α的表达显著下降（P＜0.05），见表3。

表3 各组大鼠心肌细胞凋亡指数、血清IL(−s)

表3 各组大鼠心肌细胞凋亡指数、血清IL(−s)

注:与假手术组比较,①P ＜ 0.05;与模型组比较,②P ＜ 0.05

组别 心肌细胞凋亡指数（%） IL-6（ng/L） TNF-α（ng/L）假手术组 0.58±0.43 7.04±1.24 2.35±0.57模型组 17.35±3.34� 23.42±3.54� 5.22±0.72�治疗组 10.59±4.29��� 14.62±4.62��� 3.76±0.85���

2.6 各组大鼠心肌组织中IL-6、TNF-α、α7nAChR、NF-κB p50及NF-κB p65蛋白的表达比较 与假手术组比较，模型组及治疗组心肌组织中IL-6、TNF-α、NF-κB p50及NF-κB p65蛋白的表达明显增加（P＜0.05），而α7nAChR蛋白明显下降（P＜0.05）；模型组与治疗组比较，治疗组大鼠心肌中IL-6、TNF-α、NF-κB p50及NF-κB p65蛋白的表达显著下降（P＜0.05），而α7nAChR蛋白表达显著升高（表4）。

表4 各组大鼠心肌组织中IL-6、TNF-α、α7nAChR、NF-κB p50及NF-κB p65蛋白表达的灰度值比较(−s)

表4 各组大鼠心肌组织中IL-6、TNF-α、α7nAChR、NF-κB p50及NF-κB p65蛋白表达的灰度值比较(−s)

注:与假手术组比较,①P ＜ 0.05;与模型组比较, ②P ＜ 0.05

组别 IL-6 TNF-α α7nAChR NF-κB p50 NF-κB p65假手术组 0.81±0.23 0.76±0.26 0.76±0.12 0.54±0.15 0.47±0.21模型组 1.32±1.02� 1.56±0.54� 0.42±0.21� 0.87±0.26�� 0.84±0.31��治疗组 1.06±0.62��� 1.22±0.59��� 0.56±0.24��� 0.64±0.21��� 0.71±0.25���

2.7 各组大鼠心肌组织中IL-6、TNF-α、α7nAChR、NF-κB p50及NF-κB p65 mRNA的表达比较 与假手术组比较，模型组及治疗组心肌组织中IL-6、TNF-α、NF-κB p50及NF-κB p65 mRNA的表达明显增加（P＜0.05），而α7nAChR mRNA明显下降（P＜0.05）；模型组与治疗组比较，治疗组大鼠心肌中IL-6、TNF-α、NF-κB p50及NF-κB p65 mRNA的表达显著下降（P＜0.05），而α7nAChR mRNA表达显著升高（表5）。

3 讨论

研究发现，炎性反应程度与AMI预后密切相关，抑制炎症反应可以明显改善AMI预后[9-10]，也是一个新的治疗靶点。胆碱能抗炎通路是近年来发现的一种内源性神经免疫调节通路，其作用机制与刺激通过传出迷走神经未稍释放乙酰胆碱，并与免疫细胞表面α7nAChR特异性结合，进而抑制NF-κB信号通路，减少炎性因子的释放有关。NF-κB最先由David Schatz发现的一种核蛋白因子，不仅存在于免疫细胞中，也存在于血管内皮细胞、平滑肌细胞和心肌细胞中。通常情况下，IκB与NF-κB p65（含DNA结合位点）、p50（含移位信号）两个亚单位的二聚体以失活状态存在于细胞质中，两个亚单位受IκB抑制分子的调节。AMI发生时，IL-6、TNF-α等促炎因子表达增多，细胞质内的IκB激酶被激活，IκB部分被降解，移位信号和DNA结合位点显露，含有两个亚单位的二聚体被迅速转移进入细胞核内激活靶基因，促进了多种炎性因子如IL-1、IL-2、IL-6、IL-8及TNF-α等基因的表达，大量炎性介质释放，从而诱导过度炎症反应的发生，造成心肌损伤。通过干预α7nAChR通路，可以加重或减轻AMI损伤引起的炎症反应所致的心肌细胞凋亡，促进或加重心室重构，改善/恶化心功能。

表5 各组大鼠心肌组织中IL-6、TNF-α、α7nAChR、NF-κB p50及NF-κB p65 mRNA相对表达强度比较(−s)

表5 各组大鼠心肌组织中IL-6、TNF-α、α7nAChR、NF-κB p50及NF-κB p65 mRNA相对表达强度比较(−s)

注:与假手术组比较,①P ＜ 0.05;与模型组比较, ②P ＜ 0.05

组别 IL-6 TNF-α α7nAChR NF-κB p50 NF-κB p65假手术组 0.55±0.16 0.64±0.13 0.73±0.27 0.60±0.21 0.56±0.24模型组 2.12±1.14� 1.76±0.79� 0.32±0.19� 1.37±0.35� 1.11±0.38�治疗组 1.26±0.62��� 1.17±0.52��� 0.46±0.31��� 0.84±0.39��� 0.75±0.28���

本研究发现应用芪参益气滴丸可以减轻AMI后心肌细胞的凋亡，改善心脏结构，提高心功能，减轻AMI损伤引发的炎症反应。应用芪参益气滴丸进行治疗AMI的大鼠后，大鼠血清及心脏组织中α7nAChR的表达显著升高，炎症因子IL-6、TNF-α表达明显减少，提示其抗炎作用的发挥与α7nAChR抗炎通路有关。目前研究发现，芪参益气滴丸可通过抑制胞质型磷脂酶A2（cPLA2）的合成及下调HMGB1表达，减少或下调下游炎性因子的释放[11-12]；也可通过TLR-4/NF-κB信号通路，下调炎性因子的表达[13]。由于中药制剂成份复杂的特性，在目前的现有的研究中（包括本研究）共同存在不足之处，没有明确芪参益气滴丸中所含具体的哪种和/或多种化学成份单独或共同发挥了抗炎作用。由此可见，芪参益气滴丸抗炎作用机制非常复杂，是通过多因素、多途径、多靶点启动内源性的调节机制，发挥其强大的抗炎作用。

尽管目前的研究共同显示了芪参益气滴丸在大鼠AMI后发挥的抗炎作用及不同的抗炎机制，但其相关机制中，是否以胆碱能抗炎通路机制占优势，还是其他通路机制占优势，现不明确，也未见研究，提示这将是下一步的研究工作的方向。