锑在斑马鱼不同组织中的积累及其对抗氧化系统的影响

徐琨 杨爱江，2，3 胡霞，2，3 邹海洮 李彬 刘吉

（1. 贵州大学资源与环境工程学院，贵阳 550025；2. 贵州大学环境工程规划设计研究院，贵阳 550025；3. 贵州喀斯特环境生态系统教育部野外科学观测研究站，贵阳 550025）

锑（antimony，Sb）在自然界中分布广泛，具有潜在毒性和致癌性，对心血管、呼吸系统和肝脏等具有危害［1-2］。锑主要有：-3、0、+3和+5四种价态形式，单质Sb毒性大于Sb化合物，无机锑毒性大于有机锑，Sb（III）化合物毒性是Sb（V）化合物的10多倍［3］。锑能通过风化、火山爆发、海洋喷溅、森林火灾和生物源等自然排放过程释放到环境中［4］，也可通过人类活动（采矿、冶炼和化石燃料燃烧等）向环境中释放，造成环境的污染。中国是锑资源大国，锑储、产量均位列全球第一［5］，随之而来的是锑矿开采、冶炼及尾矿浸出液等大量含锑废水排入附近水体，中国西南部的乌江、资江都受到了严重的锑污染［6］。有研究发现，湖南锡矿山周边水体锑浓度最高可达29.42 mg/L［7］，新西兰矿山附近Dúbrava水域锑浓度最高可达9.30 mg/L［8］，分别为世界卫生组织饮用水标准中锑限值的5 884.6、1 860倍，矿山水体锑污染形势严峻。

当水生生物暴露在富含重金属的水体中时，其组织和器官可通过不同方式富集重金属，例如体表与水中重金属的渗透交换作用，摄食、呼吸等生理途径［9-10］。并会对生物体产生氧化胁迫作用，产生如超氧阴离子自由基（O2-·）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（·OH）等对机体有害的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）［11］。 为 应 对 这种氧化应激反应，生物体会产生如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）等抗氧化剂，能结合并清除ROS，从而防止机体遭受氧化损伤［12］。通过研究机体抗氧化因子等生态毒理指标，可以初步了解重金属对鱼体抗氧化系统的影响［13-15］。本实验受试生物斑马鱼是一种小型热带鱼，因其具有与人类基因高度相似性、饲养容易、可全年连续繁殖、体积小，可大大降低试验毒物的成本减少浪费等众多优势而成为生态毒理学研究的首选模式生物，被越来越广泛地应用在生态毒理学及其他方面的研究中［16］。

本研究以斑马鱼为对象，研究不同浓度锑胁迫下Sb在斑马鱼肝、脑、鳃、肌肉中锑累积情况及其对各组织中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽（GSH）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）的影响，以期为矿山水体锑污染的生态毒理效应及生态风险评估提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试鱼类与养殖条件 实验成年斑马鱼采购于市场，体长2-4 cm。养殖于实验室中，光暗周期为 t（光）∶t（暗）=16 h∶8 h。养殖水环境条件：水缸24 h曝气、夏季及冬季水温均维持28℃（斑马鱼生长最适温度）、pH 6.8、溶解氧7.8-8.2 mg/L。自来水曝气3 d后，放入斑马鱼进行养殖，配置自动过滤器、加热棒。每三日清洗过滤器中粪便及残余饵料，并补充蒸发水分（曝气3 d），每日于9：00及17：00喂食两次，驯养两周，死亡率小于1%方可用于毒理实验。

1.1.2 仪器 双道原子荧光光度计（AFS-8520）、冷冻干燥机（PD-1A-50）、紫外分光光度计（S1020）、酶标仪（RT-6500）、冷冻离心机（H2-16KR）、全自动样品冷冻研磨（JXFSTPRP-CL）、恒温水浴锅。

1.1.3 主要试剂 酒石酸锑钾（分析纯）、HNO3（优级纯）、H2O2（优级纯）、硫脲、抗坏血酸。试剂盒：总蛋白（TP）、丙二醛、还原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶（所有试剂盒均购于南京建成生物工程研究所）。

1.2 方法

1.2.1 实验设计 在课题组前期研究结果基础上［17］，本实验设 0、13.26、26.53、39.79 mg/L 4 个处理组，每个处理组设3个平行。鱼缸暴露液体积2 L，每缸投放斑马鱼10条，实验共进行14 d，实验采用静态换水法，每2 d更换50%锑溶液，每天于9：00和16：00进行喂食，实验随机取用成年斑马鱼，个体大小均匀未染病。解剖前24 h禁食，于暴露第14天时采集鱼不同组织样品。

1.2.2 样品采集 于暴露第14天时捞出斑马鱼，用蒸馏水冲洗鱼体表面并用滤纸吸干，冰浴解剖，迅速取斑马鱼肝脏、脑、鳃、肌肉等组织，并用预冷的0.9%生理盐水进行冲洗，滤纸吸干并称重后置于2 mL离心管中，处理后用于锑含量测定。将迅速解剖后的斑马鱼组织进行冰浴匀浆，制备组织匀浆液进行后续酶活测定。

1.2.3 样品测定 将斑马鱼组织样品进行冷冻干燥，并放入研磨机中研磨至粉状，准确称取0.01 g样品于聚四氟乙烯的高压密闭消解罐内胆中进行消解，用双道原子荧光光度计进行测定。

按重量∶体积=1∶9加入冰生理盐水，冰浴匀浆，将匀浆液于2 500 r/min离心10 min，取上清液即为10%的组织匀浆，稀释10倍即得1%组织匀浆。TP、MDA、GSH、SOD依照试剂盒说明书进行处理、测定。其中，TP采用考马斯亮蓝法、MDA采用硫代巴比妥酸（TBA）法、GSH采用微板法、SOD采用羟胺法、CAT使用钼酸铵法，使用紫外分光光度计及酶标仪进行测定。

1.2.4 数据分析 使用 SPSS 25统计软件进行单因素ANOVA方差分析，P＜0.05表示差异显著。使用Origin 2019进行绘图。所有数据均表示为平均值±标准差。

2 结果

2.1 斑马鱼各组织中锑积累情况及含量变化

实验测定了暴露于不同浓度Sb溶液中14 d后斑马鱼肝脏、脑、鳃、肌肉组织的积累情况及含量变化，如图1所示。与对照组相比，Sb在斑马鱼各组织中均有明显的积累，随着胁迫浓度增大，Sb积累量增多，且积累顺序为：肝脏＞鳃＞肌肉＞脑，锑最高积累量分别达到（mg/g）：87.70±3.97、14.10±1.40、27.72±1.80、14.38±0.25。

图1 对照组和不同浓度锑处理组中斑马鱼肝、脑、鳃、肌肉中总锑含量Fig.1 Total antimony content in liver, brain, gill and muscle of zebrafish under different concentrations of antimony treatment

2.2 锑对斑马鱼各组织中SOD活性变化影响

图2展示了不同浓度锑对斑马鱼各组织SOD活性变化影响。从图中看出，随着锑胁迫浓度升高，肝脏SOD活性也逐渐升高，在Sb浓度为39.79 mg/L时达到最大，为174.98 U/mgprot；鳃SOD活性随着胁迫浓度的升高，呈现先升高再下降的趋势，在Sb浓度为26.53 mg/L时达到最大，为158.43 U/mgprot；脑SOD活性随着胁迫浓度的升高，呈现先下降再升高的趋势，在Sb浓度为39.79 mg/L时达到最大，为118.41 U/mgprot；肌肉SOD活性随着胁迫浓度的升高，呈现先下降再升高再下降的趋势，在Sb浓度为0 mg/L时达到最大，为139.36 U/mgprot。

2.3 锑对斑马鱼各组织中CAT活性变化影响

图3展示了不同浓度锑对斑马鱼各组织CAT活性变化影响。从图中可以看出肝脏、脑、鳃、肌肉CAT活性随着胁迫浓度的升高，均呈现先升高再下降的趋势。除鳃（在Sb胁迫浓度为13.26 mg/L时达到最大，为22.45 U/mgprot）外，肝脏、脑、肌肉CAT活性均在Sb胁迫浓度为26.53 mg/L时达到最大，分别为 97.22、35.67、22.72 U/mgprot。

图2 不同浓度锑处理组中斑马鱼肝、脑、鳃、肌肉SOD活性Fig.2 SOD activity in liver, brain, gill and muscle of zebrafish under different concentrations of antimony treatment

图3 不同浓度锑处理组中斑马鱼肝、脑、鳃、肌肉CAT活性Fig.3 SOD activity in liver, brain, gill and muscle of zebrafish under different concentrations of antimony treatment

2.4 锑对斑马鱼各组织中GSH含量变化影响

图4展示了不同浓度锑对斑马鱼各组织GSH含量变化影响。从图中可以看出肝脏、脑、鳃、肌肉GSH含量随着胁迫浓度的升高，均呈现先升高再下降的趋势。除肝脏（在Sb胁迫浓度为26.53 mg/L时达到最大，为500.91 μmol/gprot）外，脑、鳃、肌肉GSH含量均在Sb胁迫浓度为13.26 mg/L时达到最大，分别为 1092.57、619.85、667.21 U/mgprot。

图4 不同浓度锑处理组中斑马鱼肝、脑、鳃、肌肉GSH含量Fig.4 GSH content in liver, brain, gill and muscle of zebrafish under different concentrations of antimony treatment

2.5 锑对斑马鱼各组织中MDA含量变化的影响

图5展示了不同浓度锑对斑马鱼各组织MDA含量变化影响。从图中可以看出肝脏、脑、鳃、肌肉GSH活性随着胁迫浓度的升高，呈现逐渐升高的趋势。肝脏、脑、鳃及肌肉MDA含量均在Sb胁迫浓度为39.79 mg/L时达到最大，分别为30.27、44.68、34.62、28.50 μmol/gprot。

3 讨论

3.1 斑马鱼各组织中锑积累情况及含量变化

鱼类可不断摄取蓄积水中重金属，但鱼体排出速率较小，重金属在鱼体中的浓度不断增加，对鱼类产生毒害作用［18］。本研究中，Sb可在斑马鱼各组织中积累，其中在肝脏、鳃中积累较多，在脑及肌肉中积累较少。这是由于肝脏是鱼体内进行有毒物质转化、储存和解毒的重要场所，其中的金属硫蛋白（metallothionein，MT）在受到重金属刺激后可快速大量合成，因此肝脏中常积累大量重金属［19］，任何对肝脏的损伤最终都会导致鱼类生理上的紊乱，严重的会导致鱼类的死亡。鱼体通过鳃直接进行呼吸接触水体，由于鳃膜能提供一个带静负电荷的表面［20］，因此鳃与其他器官相比，可直接与水相接触吸附水中游离的重金属离子，使更多的重金属积累和吸附。相比之下，由于肌肉、脑等合成金属硫蛋白能力较弱，对重金属亲和性较低，重金属的积累量较其他组织少［21］。因而肝脏、鳃等新陈代谢活跃的鱼类组织，与肌肉、脑等其他组织相比，可能会积累更高水平的金属。El-Moselhy等［22］通过测定埃及红海3个主要登陆区采集的14种底栖和远洋鱼类的肝脏、鳃和肌肉中5种重金属的浓度发现，肌肉中5种重金属的浓度最低，Cu、Zn和Fe在肝脏中浓度最高，Pb和Mn在鳃中的浓度最高；有研究发现，尖齿胡鲶鱼在5 mg/L Cu溶液中暴露15 d后，肝脏中Cu含量最高，达到287.1 μg/g；其次为鳃积累量最多，为39.99 μg/g，而肌肉积累量最低，为 3.696 μg/g［23］。

图5 不同浓度锑处理组中斑马鱼肝、脑、鳃、肌肉MDA含量Fig.5 MDA content in liver, brain, gill and muscle of zebrafish under different concentrations of antimony treatment

由于鱼体内的金属排除速度小于累积速度，因此重金属将在鱼体中积累并长时间存留［24］。重金属对鱼类死亡率的影响取决于暴露浓度及暴露时间［25］。本研究中，相同暴露时间下，随着Sb暴露浓度的增加，各组织中Sb含量也逐渐增加。类似的关于重金属浓度与鱼体重金属含量关系研究发现，幼年虱目鱼分别暴露在镉处理组（3.15、6.3和12.6 mg/L）中，3周后，肝镉含量分别为129 mg/g±7 mg/g、222 mg/g±8 mg/g和 368 mg/g±22 mg/g，分别为对照组的90、160和260倍。Zhang等［26］研究发现，当金鱼分别暴露于5 mg/L Cd、Pb溶液18 d时，其肝脏、鳃、肾脏组织中重金属含量为0.5 mg/L Cd、Pb暴露时的1.14-3.97倍。

3.2 锑对斑马鱼各组织SOD活性变化影响

SOD是一类金属酶，能与生物体内活性氧自由基发生反应，促使O2-·与H+歧化生成H2O2和O2，H2O2会被体内其他酶分解为无害的H2O，从而达到抗氧化的目的［27］。本研究中，肝脏、鳃中处理组SOD活性大于对照组，脑Sb（26.53、39.79 mg/L）处理组SOD活性大于对照组。这可能是由于长期暴露于Sb中，随着Sb的积累，氧化胁迫程度加剧，使得SOD代偿性大量表达，更积极地参与O2-·向H2O2的转化［28］。这与 Aytekin 等［29］研究罗非鱼暴露于0.1 mg/L和1.0 mg/g浓度的Cd+Cu+Cr+Pb+Zn溶液中7 d和14 d后，肝脏和鳃中SOD活性水平升高的结果相似。本研究中，暴露于Sb（26.53 mg/L）的鳃中SOD活性最高，大于Sb（39.79 mg/L）胁迫时SOD活性，表现为Hormesis毒物兴奋效应［30］。肌肉处理组SOD活性均小于对照组，这可能是因为高浓度Sb胁迫下，产生过量活性氧自由基使得SOD产生与活性氧消除之间的平衡打破，SOD活性下降［31］。同样的，将斑马鱼长期暴露于不同浓度铊溶液中，鳃SOD活性在铊浓度为0.5 μg/L时达到最大，后在1 μg/L时SOD活性开始下降，似乎存在一个阈值响应，而不是浓度响应［32］。将斑马鱼暴露于0.05%、0.25%、0.50%、1.00%铀矿尾矿浸出液中14 d后发现肌肉SOD活性变化与本实验结果相似［16］。脑在Sb（13.26 mg/L）胁迫下SOD值均明显小于其余组，这可能是由于脑细胞在接触到Sb后造成了部分损伤。随着胁迫浓度增加，未损伤的细胞中SOD产生代偿性表达，补偿了受损细胞的部分。

3.3 锑对斑马鱼各组织CAT活性变化影响

CAT是一种含血红素的酶，其可将H2O2代谢为H2O和O2来促进H2O2的去除，并阻止其与O2在铁螯合物作用下反应生成有害的羟基自由基（·OH）［33-34］，CAT是所有酶中转化率最高的酶之一：一个CAT分子每分钟可以将600万个H2O2分子转化为H2O和O2［35］。在本研究中，斑马鱼各组织CAT活性随着Sb的增加均呈现先升高后下降的趋势，表现为Hormesis现象［30］。CAT活性在低浓度时升高可能是由于机体受到重金属刺激后排毒机制启动，诱导CAT活性的表达。在高浓度下活性抑制，这可能与金属离子与酶分子上的-SH基团的直接结合，由于氧化应激而增加的过氧化氢和超氧自由基有关［36］。Xie等［37］研究黄鲶鱼暴露于不同浓度的 Cd溶液（50、200 μg/L）中 56 d后，50 μg/L胁迫浓度时的CAT活性高于200 μg/L胁迫浓度时的CAT活性；麻艳群等［38］将禾花鲤暴露于不同浓度Cu（0、0.067、0.084、0.101、0.118、0.134 mg/L）的含铅水溶液中11 d，发现低浓度Cu对血液和肝脏中的CAT活性具有一定的促进作用，高浓度时则相反。在本研究中，斑马鱼肝脏中CAT的活性是最高的，这与肝组织中Sb的生物积累量最高有关。

3.4 锑对斑马鱼各组织GSH含量变化影响

GSH可参与细胞抵御外源性药物、氧自由基和金属阳离子的毒性作用［39］。是一种富含巯基（-SH）的三肽，具有对金属阳离子的高亲和力的特征，可与各种金属形成GS-金属配合物［40］，并通过硫醇尿酸的形式排出体外，以此来改变金属吸收和消除的速率，防止过量金属离子对基本细胞结构造成损伤［41］。不同金属对GSH含量水平的影响不同，GSH的含量通常取决于物种、组织、金属及其暴露浓度［42］。通常，在接触金属后，细胞中的谷胱甘肽含量会增加或减少：有研究发现将Channa punctatus鱼暴露于4种微量金属镉（Cd）、铜（Cu）、铁（Fe）和镍（Ni）溶液中，与对照组相比，暴露组GSH水平显著增加［41］；而将其暴露于富含Fe和Ni的热电厂废水中时，与对照组相比，其鳃GSH水平有所下降［43］。本研究中，各组织GSH水平较对照组高，并随浓度升高，变化趋势为低浓度促进，高浓度抑制，这可能是由于在低浓度下，机体氧化应激系统及抗氧化防御系统被激活，快速合成大量GSH与重金属结合，并清除重金属胁迫产生的ROS。而高浓度时GSH 含量的下降可能是由于GSH低浓度时其消耗速度大于其产生的速度，动态平衡打破，从而导致含量下降［44］。肖丹［45］、Canesi等［46］也在生物体内探究时观察到一致的现象。

3.5 锑对斑马鱼各组织MDA含量变化影响

过量ROS能攻击生物膜上的磷脂、膜受体和酶相关的多不饱和脂肪酸等大分子物质［47］，损害膜的功能，产生脂质过氧化，脂质过氧化作用的后续产物（如氢过氧化物或醛衍生物）还可以通过抑制蛋白质合成和酶活性来改变细胞功能［48］。MDA是脂质过氧化的二级产物，通常作为脂质过氧化的生物标志物［49］。本研究中，不同浓度Sb胁迫下，斑马鱼各组织中MDA含量随着Sb浓度的增加而增加，表明水相Sb暴露下，Sb诱导了鱼体产生过量ROS，发生脂质过氧化，。Geng等［16］将斑马鱼暴露于不同浓度（0.05%、0.25%、0.50%、1.00%）铀矿尾矿浸出液中14 d，曾乐意等［50］通过饲喂中华倒刺鲃不同浓度（2 500、5 000 μg/g）Pb饲料56 d后，发现鱼体各组织中MDA含量均与重金属浓度呈正相关关系，本实验结果相似。

4 结论

不同浓度锑胁迫下，斑马鱼各组织可产生明显的锑积累，积累顺序为：肝脏＞鳃＞肌肉＞脑，且随着暴露浓度不断增大，锑积累量也逐渐增多，各组织最高锑积累量分别达到：87.70 mg/g±3.97 mg/g、27.72 mg/g±1.80 mg/g、14.38 mg/g±0.25 mg/g、14.10 mg/g±1.40 mg/g。对SOD、CAT、GSH及MDA等生化指标的研究发现，锑暴露可使机体产生脂质过氧化，同时激活抗氧化防御系统缓解毒害作用，并随着胁迫浓度的增加产生一定的变化趋势。