防治水稻纹枯病的两种纳米微囊的制备与杀菌活性

李柠君，崔建霞，黄秉娜，蒋佳俊，安长成，王琰

（中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所，北京 100081）

水稻纹枯病是由立枯丝核菌引起的一种真菌病害，在温度高、湿度大的条件下容易发生，是世界上分布广、危害大的水稻病害之一。当前由于氮素化肥使用水平的提升以及矮秆、杂交水稻等特定水稻品种的推广，纹枯病的发生越来越严重，成为制约水稻生产的重要限制因素［1-3］。农药在控制有害生物为害、保障农业生产安全和提高作物产量等方面发挥着重要作用，但目前利用率降低等问题日渐突出［4］，因此通过新药研制及剂型创新等方法提高农药利用率，减少农药使用量成为现代农药发展的必经之路。其中，以纳米囊化技术为代表的纳米技术的发展为农药新剂型的研制提供了思路。纳米农药具有靶向性强、缓控释、环境友好等优点，此外由于其小尺寸效应和大比表面积，在提高农药叶面沉积和展布方面也具有明显的优势，是当前绿色环保剂型的研究热点［5-7］。使用微囊剂防治水稻纹枯病有利于延长药效、提高稳定性、减少施药次数和农药用量［8］。目前，以纳米微囊剂为代表的纳米农药在材料、制备方法、结构等方面取得了较大的发展。关文勋等［9］利用阿维菌素具有的2个活性羟基，连续与丙烯酰氯、四乙烯五胺和琥珀酸酐反应，制备了带有酯键并对药物亲和的乳化剂前体，乳化剂前体经中和后，可以与阿维菌素在水中自发形成稳定的纳米农药乳液，显示出一系列的优良性能和更好的杀虫效果；纳米乳液的粒径可以通过改变乳液载药量或乳化剂中和程度来调节。张大侠等［10］以多壁碳纳米管与柠檬酸聚合物的复合材料为载体对代森锌和代森锰锌进行包覆，成功将大颗粒的农药转变成纳米农药。阎建辉等［11］用硬脂酸对Ag／TiO2表面进行了改性，其表面由亲水性变为亲油性，将溴虫腈农药、改性Ag／TiO2和相应的添加剂混合制成颗粒分布较均匀、平均粒径为100 nm的纳米农药制剂；在田间药效对比试验中，施药剂量减少一半条件下，纳米制剂防治甘蓝斜纹夜蛾的田间防效优于溴虫腈乳油。

井冈霉素是一种放线菌产生的抗生素，具有较强的内吸性，易被菌体细胞吸收、传导，从而干扰和抑制菌体细胞生长发育，是我国防治水稻纹枯病应用时间较长的农药，但多年持续、重复的使用其利用率降低，成为亟待解决的问题［12］；噻呋酰胺是一种新型苯酰胺类低毒广谱型杀菌剂，具有很强的内吸传导性，杀菌效力高，持效期长，主要抑制病菌三羧酸循环中的酸去氢酶，对由立枯丝核菌属引起的纹枯病有良好的防治效果，是当前防治水稻纹枯病的新型药剂［13-15］。本研究选用使用时间较久的井冈霉素和新药代表噻呋酰胺为研究对象，旨在改善药剂性能的同时，推广新型杀菌剂。本试验通过W／O／W 复乳法结合高压均质技术分别制备了井冈霉素和噻呋酰胺两种农药纳米剂型，对其粒径、形貌、叶面粘附性以及室内杀菌活性进行了探究，旨在为提高农药利用率提供研究思路与技术手段。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

聚乙烯醇（PVA，87% ～90%，Mw＝30 000～70 000），上海西格玛奥德里奇贸易有限公司；聚羧酸盐，江苏擎宇化工科技有限公司；井冈霉素A（60%）原药、噻呋酰胺（95%）原药，北京百乐欣生物科技有限公司；井冈霉素标准品，北京莱伯沃德科技有限公司；噻呋酰胺标准品，北京百灵威科技有限公司；市售5%井冈霉素水剂，江西绿川生物科技实业有限公司；市售28%井冈霉素可湿性粉剂，浙江钱江生物化学股份有限公司；市售24%噻呋酰胺悬浮剂，日产化学工业株式会社；甲醇（色谱级）、乙腈（色谱级），赛默飞世尔科技（中国）有限公司；二氯甲烷（分析纯）、三氯甲烷（分析纯），北京化工厂。

供试菌种：立枯丝核菌（Rhizoctonia solani），北京阿格勒科技有限公司。

Hitachi SU-8010型扫描电镜、Hitachi HT7700透射电子显微镜，日本日立株式会社；Zetasizer Nano ZS90纳米粒度分析仪，英国马尔文公司；Agilent1260 Infinity高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；JY92-IIN超声波粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；Elix Essential 5纯水机，美国密理博公司；RCH-1000磁力搅拌器，日本东京理化器械株式会社；超微量天平，上海梅特勒-托利多国际贸易有限公司；环境扫描电子显微镜，美国赛默飞世尔科技有限公司；旋转蒸发仪，赛洛捷克科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 纳米微囊的制备 选取安全、可降解、低成本的高分子材料聚乳酸（PLA）作为囊材，通过复乳法结合高压均质技术制备纳米农药剂型。根据药物理化性质选择合适溶剂分别制备相应内水相和油相，外水相为一定浓度的表面活性剂溶液。以井冈霉素为研究对象时，将井冈霉素A原药溶于超纯水中形成的井冈霉素水溶液作为内水相，油相为溶解一定质量PLA的二氯甲烷，聚乙烯醇和聚羧酸盐按照1∶2的比例配置1.3%的表面活性剂溶液得到外水相；以噻呋酰胺为研究对象时，超纯水作为内水相，将噻呋酰胺原药、PLA溶解于二氯甲烷中构成油相，聚乙烯醇和聚羧酸盐按照1∶2的比例配置1.3%的表面活性剂溶液得到外水相。

图1 纳米农药剂型制备示意图

将内水相分散在油相中形成W／O型初乳液；在机械破碎的条件下将W／O型初乳液缓慢滴加到外水相中制备W／O／W 型粗乳液，最后通过高压均质技术形成均一化乳液。将所得乳液室温下搅拌挥发掉有机溶剂固化成囊，制备得到纳米悬浮剂，干燥后得到固体纳米微囊剂型（图1）。

1.2.2 纳米微囊的粒径测定及形貌表征 取少量离心后的固体沉淀用去离子水稀释至透明状态，通过Zetasizer Nano ZS90纳米粒度分析仪测量纳米载药系统的平均粒径和多分散指数（polydispersity index，PDI），每个样品平行测定3次；吸取适量稀释后的溶液滴于镀有碳膜的300目铜网以及硅片光滑面上铺展均匀，室温状态下自然晾干，得到透射电子显微镜和扫描电子显微镜样品。通过扫描电子显微镜对纳米微囊的形貌进行表征，透射电子显微镜对其内部结构进行表征。

1.2.3 纳米微囊的载药量测定 用超微量天平分别准确称量井冈霉素纳米载药系统和噻呋酰胺纳米载药系统冻干粉各10 mg，使其完全溶解于三氯甲烷中并通过旋转蒸发仪除去多余的溶剂，用90%甲醇浸泡后，经0.22μm滤膜过滤，用高效液相色谱（HPLC）法对载药系统中的药物浓度进行测定。

井冈霉素HPLC测定条件：C18反相柱（250mm ×4.6 mm ×5μm），流动相为0.005 mol／L磷酸氢二钠-磷酸（用磷酸调节pH＝7）+2%甲醇，流速为0.8 mL／min，检测波长为210 nm，柱温为30℃，进样量为20μL。

噻呋酰胺HPLC测定条件：C18反相柱（250 mm ×4.6 mm ×5μm），流动相为乙腈-水（体积比为7∶3），流速为1.0 mL／min，检测波长为225 nm，柱温为30℃，进样量为20μL。

载药量计算公式：

1.2.4 纳米微囊的叶面展布性能测定 选取疏水性模式作物水稻作为研究对象，以井冈霉素纳米微囊为例，探究纳米微囊在植株叶面上的铺展性能。将井冈霉素纳米微囊样品喷洒在水稻植株叶表面，室温下自然晾干后，通过环境扫描电子显微镜观察样品在叶片上的分布状态。

1.2.5 纳米微囊的叶面接触角测定 以水稻为研究对象，以市售井冈霉素水剂和市售噻呋酰胺悬浮剂为对照，通过接触角测量仪探究两种纳米载药系统的叶面接触行为。取大小合适的新鲜水稻叶片用双面胶固定于载玻片，该过程注意保护水稻叶片的结构完整。调整接触角测量仪视野、参数至最佳状态，通过微量注射器将待测样品滴加至叶片表面，待药液稳定后立即捕捉药液与叶片的接触图像，通过五点拟合法测定接触角大小，重复5次取平均值。

[13][14] HELCOM, Helsinki Convention, http://www.helcom.fi/about-us/convention/.

1.2.6 纳米微囊的杀菌活性测定 以立枯丝核菌作为模式真菌，通过菌丝抑制法对井冈霉素纳米载药系统和噻呋酰胺纳米载药系统的室内毒力进行评价，浓度梯度设置如表1所示。无菌去离子水加入无菌溶化培养基中作为空白对照；将活化后的立枯丝核菌用直径为5 mm打孔器压出生长状态相同的菌饼接种于直径为90 mm的PDA平板中心，每个浓度重复3次。采用十字交叉法统计菌落直径，通过对各样品生长抑制率和半数效应浓度（EC50）的计算，分析所制备纳米载药系统的室内毒力。

表1 供试药剂试验浓度

通过下列公式计算生长抑制率：

其中I是立枯丝核菌生长抑制率；Dc和Dt分别为空白对照组和处理组的菌落直径；Dd为菌饼直径（5 mm）。

1.3 数据统计与分析

采用Microsoft Excel对数据进行分析，结果以“平均值±标准差”表示。采用DPS和SPSS 18.0软件分别进行毒力线性回归分析和接触角显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 两种纳米微囊的粒径分布及形貌表征

井冈霉素纳米微囊和噻呋酰胺纳米微囊粒径大小约为300 nm左右，PDI均小于0.3，表明颗粒间分散性良好（图2）。通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜对两种纳米微囊的形貌以及结构进行表征，结果（图3）显示，均呈现分散性良好、表面光滑、形貌规则的圆球。

图2 纳米微囊的水合粒径分布

2.2 纳米微囊的叶面展布性能

2.3 两种纳米微囊的叶面接触角分析

改善农药在靶标植株上的叶面铺展性是提高农药有效利用率的方法之一。本试验以疏水性水稻叶片为研究对象，通过接触角的大小来评估纳米微囊在靶标植株上的叶面粘附性能。结果如图5所示，井冈霉素纳米微囊、市售井冈霉素水剂、噻呋酰胺纳米微囊以及市售噻呋酰胺悬浮剂在疏水性水稻叶片上的叶面接触角分别为106.97±1.79°、141.43±2.46°、97.55±1.18°和119.03±10.14°，所制备的纳米微囊在疏水性的水稻叶片上有更小的叶面接触角，且与市售剂型存在显著性差异（P＜0.05）。表明纳米微囊有更好的叶面铺展性能，从而改善叶片润湿性，避免因药液滚落造成农药损失，进一步提高农药有效利用率。

图3 纳米微囊的扫描电镜和透射电镜图

图4 纳米微囊在水稻叶片上的分布

图5 不同杀菌剂在水稻叶面上的接触角比较

2.4 两种纳米微囊的含药量及杀菌活性

为验证纳米微囊作为新型农药制剂的可行性，对井冈霉素纳米载药体系和噻呋酰胺纳米载药体系的室内抑菌活性进行探究。井冈霉素纳米微囊和噻呋酰胺纳米微囊的载药量分别为9.5%和15.4%。由表2可知，井冈霉素纳米微囊、噻呋酰胺纳米微囊、市售井冈霉素可湿性粉剂和市售噻呋酰胺悬浮剂的EC50分别为389.5295、3.6872、450.3471μg／mL和5.1871μg／mL，表明两种纳米微囊都具有提高药效的作用和较好的抑菌效果（图6）。

表2 不同杀菌剂对立枯丝核菌的杀菌活性

图6 不同杀菌剂对立枯丝核菌的杀菌效果

3 讨论与结论

传统制备方法与高压均质技术相结合，可以将药剂进一步细化，实现载药颗粒高度精细化，使载药粒子均匀、稳定。且高压均质简单易操作，能够实现量化生产。Pan等［17］结合高压均质法制备了5%氯氟氰菊酯纳米悬浮液，该悬浮剂粒径均一，性能稳定。

从纳米药剂独特的性质分析，其具有小尺寸效应和大比表面积，可以增加药液与靶标叶面的接触面积，提高其叶面润湿性能和分散沉积性能，有利于增强其对靶标的作用效率［18］。因此纳米农药有潜力成为改善传统药剂持效期短、利用率低的重要手段之一，开发安全高效的纳米药剂也将成为重要的研发热点。在防治水稻纹枯病的过程中，开发纳米药剂不仅仅聚焦在新药的研发上，还将以使用时间悠久的传统药剂作为对象，利用纳米技术和纳米材料对其进行改善，提高其利用率。

在本研究中，采用复乳法结合高压均质技术分别制备了井冈霉素纳米微囊和噻呋酰胺纳米微囊，得到的两种微囊均呈现出形貌均一、分散性良好的球形，且粒径在300 nm左右，有利于发挥其小尺寸效应。与市售井冈霉素水剂和噻呋酰胺悬浮剂相比，两种纳米微囊具有更好的叶面接触性能，可以减少因药液滚落而造成的农药损失，有利于提高农药有效利用率。杀菌活性结果表明，两种纳米微囊分别比市售井冈霉素可湿性粉剂和市售噻呋酰胺悬浮剂有更高的抑菌活性。

纳米技术不仅为农药的创制提供了新的制备方法，还可以对农药的性能进行改善。将农药制备技术与纳米技术相结合，利用其小尺寸效应等优势改善农药剂型的性能，以提高农药剂型的接触性能和生物活性等，可以为环保、高效农药新剂型的发展提供新思路。