胰岛素联合亚硒酸钠对高糖环境下肾小球系膜细胞增殖的影响

王菊宁，霍宇宁，任淑婷

（1.西安交通大学医学部，陕西西安 710061；2.西安培华学院，陕西西安 710125）

糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy，DN）是糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）发病过程中最常见、最严重的并发症之一[1]，其主要病理改变之一是肾小球系膜细胞的增殖和细胞外基质的增多最终导致的肾小球硬化。高血糖是引发DN发生和发展的主要因素。近年研究发现，硒具有类胰岛素样作用，能增加葡萄糖转运体的活性，促进靶组织利用葡萄糖，在降血糖的同时不增加血液中的胰岛素水平[2]。本研究拟探讨胰岛素联合亚硒酸钠在高糖环境下对肾小球系膜细胞增殖的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

人肾小球系膜细胞株（Human Mesangial Cell，HMC），西安交通大学第二附属医院肾内科付荣国教授提供；胰岛素，徐州万邦金桥制药有限公司；亚硒酸钠，西安赫特生物公司；胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS），以色列 Biological Industries；DMEM培养基，美国Hyclone公司；细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8，CCK8），碧云天生物技术有限公司；葡萄糖、甘露醇、二甲亚砜，美国Sigma。

1.2 细胞培养

复苏HMC进行培养，制备0.5×105cell/mL的HMC细胞悬液接种于96孔板，每孔100 μL，每组设置3个复孔。待细胞完全贴壁后更换含1% FBS的DMEM培养基，继续培养24 h使细胞同步化，然后再给予细胞不同处理。

1.3 葡萄糖诱导HMC增殖模型的建立

采用浓度为 0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L、25 mmol/L、30 mmol/L 和35 mmol/L的葡萄糖溶液处理HMC细胞，观察处理24 h后细胞增殖情况确定诱导HMC增殖的最佳葡萄糖浓度。为了观察高糖引起溶液渗透压增高后是否对细胞增殖有影响，除未给予任何处理的正常对照组（Control）外，同时增设与最佳葡萄糖浓度相当的30 mmol/L高渗甘露醇组（Mannitol），观察HMC在葡萄糖和高渗甘露醇作用下48 h内的增殖情况。

1.4 胰岛素或胰岛素联合亚硒酸钠抑制HMC增殖

为了明确胰岛素对高糖诱导HMC增殖的抑制作用及其最佳抑制剂量，以未给予任何处理的空白对照组（Control）和30 mmol/L甘露醇处理的高渗甘露醇组（Mannitol）作阴性对照，在最佳葡萄糖浓度诱导HMC增殖的条件下，再给予3个不同浓度（30 mU/mL、100 mU/mL、300 mU/mL）的胰岛素处理，与葡萄糖单独处理的高糖模型组（Glucose）比较，观察胰岛素对高糖诱导48 h内细胞增殖的抑制作用，筛选出胰岛素对高糖诱导HMC增殖抑制作用的最佳处理浓度。

在得到最佳胰岛素处理浓度后，基于以往对胰岛素与亚硒酸钠的最佳配伍研究[3]，分别给予最佳浓度胰岛素单独处理（Insulin）、或胰岛素与相应浓度亚硒酸钠联用处理（Insulin+Sodium Selenite）高糖诱导后的HMC，观察胰岛素联合亚硒酸钠对高糖诱导48 h内细胞增殖的抑制效果。

1.5 CCK8法检测细胞增殖

细胞培养不同时间点后弃掉孔内培养基，加入100 不同新培养基和10 基和同时间点后溶液，在培养箱中继续孵育2 h后，用酶标仪测定450 nm处的吸光度值。

1.6 统计学方法

采用Graphpad Prism 5 XML Project软件进行数据分析，数据以均数±标准差（±s）表示。各组间比较利用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 高糖诱导HMC的增殖

通过检测细胞活性，明确高糖对HMC的增殖作用。用不同浓度的葡萄糖处理HMC 24 h后，检测HMC的相对细胞活性，结果如图1a所示。随着葡萄糖浓度（5～35 mmol/L）的增加，相对细胞活性均较正常对照组（0 mmol/L Glucose）显著增加（P＜0.05）；且当葡萄糖浓度为30 mmol/L时，细胞相对活性达到峰值。因此，后续研究选用30 mmol/L葡萄糖作为诱导HMC增殖的最佳浓度。

以未给予任何处理的细胞作为正常对照组（Control），检测30 mmol/L葡萄糖（Glucose）和甘露醇（Mannitol）诱导不同时间对HMC相对细胞活性的影响，结果如图1b所示。与正常对照组和高渗甘露醇组相比，高糖（30 mmol/L葡萄糖）培养HMC 24 h、36 h和48 h的相对细胞活力均显著性上升（P＜0.05），且呈时间依赖性；而高渗甘露醇组与正常对照组相比，其相对细胞活力无显著性差异（P＞0.05）。

图1 高糖诱导HMC增殖情况

2.2 胰岛素或胰岛素联合亚硒酸钠对高糖环境下HMC增殖的影响

如图2a和2b所示，胰岛素处理后24 h和48 h，与高糖模型组（Glucose）比较，3个不同浓度胰岛素处理组的相对细胞活力均显著性降低（P＜0.05），其中100 mU/mL胰岛素组的细胞活力最低，提示胰岛素可有效抑制高糖诱导HMC的增殖，且以100 mU/mL胰岛素处理组的抑制效果最明显。

图2 胰岛素对高糖诱导HMC增殖的影响

基于以往对胰岛素与亚硒酸钠的最佳配伍研究[3]，选择100 mU/mL胰岛素联合500 ng/mL亚硒酸钠作为胰岛素联合亚硒酸钠实验的药物浓度。图3结果显示，随着处理时间的延长，与高糖模型组（Glucose）相比，100 mU/mL胰岛素处理组（Insulin）和100 mU/mL胰岛素+500 ng/mL亚硒酸钠处理组（Insulin + Sodium Selenite）的相对细胞活力均明显下降（24 h、36 h、48 h均P＜0.05）；与单独胰岛素处理组（Insulin）相比，胰岛素+亚硒酸钠组（Insulin + Sodium Selenite）的相对细胞活力降低更显著（48 h，P＜0.05）。由此可见，胰岛素及胰岛素联合亚硒酸钠均可显著抑制高糖环境下HMC的异常增殖，而胰岛素联合亚硒酸的抑制效果优于同等剂量单独胰岛素。

图3 胰岛素联合亚硒酸钠对高糖诱导HMC增殖的影响

3 结论

肾小球系膜细胞的异常增殖是DN的一个重要病理特征。本研究证实，30 mmol/L葡萄糖诱导HMC的细胞增殖显著且具有时间依赖性，而不同浓度（30 mU/mL、100 mU/mL、300 mU/mL） 的 胰 岛素可显著抑制高糖诱导HMC的异常增殖，使细胞活性显著下降，其中100 mU/mL胰岛素对高糖诱导HMC增殖的抑制效果最为显著，该浓度胰岛素联合亚硒酸钠按1∶5使用后，对高糖诱导HMC增殖的抑制效果更加显著，提示胰岛素联合亚硒酸钠可能会对糖尿病肾病引起的肾小球硬化具有重要的防治作用。