阿托伐他汀对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及炎症机制

杨晓炜,姚立岩,李海红,崔新宇,刘凤海

(牡丹江医学院公共卫生学院,黑龙江 牡丹江 157011)

缺血性脑卒中发病率高、致残率高、病死率高,严重威胁中老年人的健康。缺血性脑卒中临床主要采用溶栓治疗,但溶栓后容易引发缺血再灌注损伤,从而影响疗效[1]。脑缺血再灌注损伤与炎症反应、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸毒性等多种机制有关,现有研究证据已经证实抑制炎症反应能够减轻脑缺血再灌注损伤[2]。阿托伐他汀属于HMG-COA还原酶抑制剂,口服后,可使胆固醇的合成减少,降低低密度脂蛋白胆固醇、血清甘油三酯并增高高密度脂蛋白水平,故临床上主要用于降脂治疗。近年来,临床研究发现,阿托伐他汀的应用降低了缺血性脑卒中的发生[3]。动物实验发现[4],对于血脂水平正常的大鼠,阿托伐他汀处理后也可以减小脑缺血再灌注后的梗死体积,对神经损伤有一定的保护作用。说明除降血脂外,阿托伐他汀还可能参与减轻脑炎症反应。本实验旨在通过应用不同剂量的阿托伐他汀,观察大鼠脑缺血再灌注后神经功能评分、脑梗死体积及炎症因子hs-CRP、TNF-α、IL-10的表达,从动物实验角度探讨预防性应用阿托伐他汀对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及其可能的机制,从而为临床上应用阿托伐他汀防治缺血性脑卒中提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,体重180～220 g,由牡丹江医学院动物实验中心提供,分笼饲养,室温控制在20 ℃左右。自由进食饮水。术前禁食12 h。

1.2 药物和主要试剂阿托伐他汀( 广东阳江制药厂有限公司,纯度大于 99.19%)大鼠CRP 、TNF-α及IL-10ELISA检测试剂盒( 武汉博士德生物工程有限公司)、10%水合氯醛、生理盐水、2% TTC磷酸缓冲液、4%多聚甲醛的PBS溶液。

1.3 主要仪器-80 ℃冰箱、-20 ℃冰箱、4 ℃低温离心机、酶标仪、100～1000 μL微量加样器、分析天平、电子显微镜、数码相机。

1.4 动物分组及给药健康雄性SD大鼠,随机分成假手术组、模型组、不同剂量阿托伐他汀组[(A组:5 mg/(kg·d)、B组:10 mg/(kg·d)、C组:15 mg/(kg·d)、D组:20 mg/(kg·d)],每组按缺血再灌注3 h、6 h、12 h、24 h分为4个亚组,每个亚组8只。不同剂量阿托伐他汀组大鼠于术前14 d开始予阿托伐他汀混悬液灌胃,1 次/d;假手术组和模型组均于术前14 d开始予等容积生理盐水灌胃,1 次/d。

1.5 大鼠大脑中动脉(MCA)闭塞的脑缺血再灌注模型制备采用改良longa-Zea氏线栓法[5]制备大鼠右侧大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注模型。假手术组只分离、暴露血管,不插入栓线,其余步骤同模型组。

1.6 神经功能缺损评分参照Zea-Longa 5 分制评分标准分别于再灌注3 h,6 h,12 h,24h进行神经功能缺损评分。具体评分标准为:0分:活动无异常;1分:单侧前爪不能伸展;2分:向一侧转圈;3分:向一侧倾倒;4分:意识丧失。

1.7 脑梗死体积的测定于不同再灌注时间点颈椎离断,冰上快速取脑,-20 ℃速冻20 min,冠状切片,切片厚度约1.0 mm,共5个脑片,将脑片浸泡于2% TTC磷酸盐缓冲液中,37 ℃避光孵育30 min,正常脑组织染成红色,梗死灶不着色。脑片着色后拍照,使用Image J图像分析系统计算梗死体积。大鼠脑梗死体积百分比=(正常侧大脑半球体积-梗死侧非梗死区大脑半球的体积)/正常侧大脑半球体积。

1.8 血清炎症因子测定大鼠腹主动脉采血,分离血清。采用 ELISA法检测各组血清hs-CRP、TNF-α和IL-10的水平。实验方法按照ELISA试剂盒说明书操作。

1.9 统计学分析实验数据以“均数±标准差”表示,应用SPSS 23.0统计软件分析。神经功能评分采用Wilocoxon秩和检验;同一指标组间的比较采用单因素方差分析,组间多重比较方差齐时采用SNK-Q检验,方差不齐采用Dunnetts T3检验。P<0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能缺损评分相同再灌注时间点,假手术组无神经功能缺损表现,模型组神经功能缺损症状明显;各不同剂量阿托伐他汀组较模型组神经功能缺损评分降低,再灌注3 h及6 h,仅最高剂量组与模型组比较降低有统计学意义(P<0.05),灌注12 h和24 h各剂量组与模型组比较降低均有统计学意义且随剂量增加神经功能评分降低程度逐渐加强(P<0.05),见表1。

表1 各组各相同再灌注时间点神经功能缺损评分

2.2 脑梗死体积测定结果假手术组各时间点均未见梗死灶;模型组缺血侧脑组织于再灌注3 h即出现梗死灶,随再灌注时间的延长脑梗死体积逐渐增大;不同剂量阿托伐他汀组梗死体积小于模型组。再灌注3 h仅最高剂量组与模型组比较缩小有统计学意义(P<0.05),再灌注6 h,12 h,24 h各剂量组与模型组比较缩小均具有统计学意义(P<0.05),且各相同时间点随剂量的增加梗死体积缩小更为显著(P<0.05)，见表2、图1。

表2 各组各相同再灌注时间点脑梗死体积百分比

图1 缺血再灌注24 h各组脑梗死体积比较

2.3 血清炎症因子测定结果再灌注3 h各组hs-CRP水平无统计学差异 (P>0.05)。再灌注6 h、12 h、24 h模型组较假手术组升高且具有统计学意义(P<0.05),阿托伐他汀组较模型组有所降低且对于hs-CRP的影响随着剂量增高而增强,差异均有统计学意义(P<0.05);假手术组TNF-α含量较低;模型组再灌注各时间点均高于假手术组,差异均具有统计学意义(P<0.05)不同剂量阿托伐他汀组较模型组有所降低,其中3 h、6 h不同剂量组间差异无统计学意义(P>0.05)。12 h、24 h不同剂量阿托伐他汀对于TNF-α的影响随着剂量增高而增强,差异有统计学意义(P<0.05);再灌注3 h各组IL-10无统计学差异(P>0.05),再灌注6 h、12 h 和24 h模型组较假手术组升高(P<0.05),与模型组比较,同一时点随阿托伐他汀剂量增加IL-10升高更加明显(P<0.05)。见表3、表4、表5。

表3 缺血再灌注3 h、6 h、12 h、24 h的hs-CRP表达水平

表4 缺血再灌注3 h、6 h、12 h、24 h的TNF-α表达水平

表5 缺血再灌注3 h、6 h、12 h、24 h的IL-10表达水平

3 讨论

3.1 不同剂量阿托伐他汀对脑缺血再灌注损伤的保护作用阿托伐他汀不仅可以调血脂,还可以调节血管内皮功能、防止血栓形成、抑制炎性反应等,具有功能多效性。本研究通过线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,造模后3 h开始大鼠出现脑缺血损伤表现,神经功能损伤明显,脑梗死灶出现并随时间推移逐渐扩大。通过不同剂量阿托伐他汀预处理我们发现,与模型组比较,不同剂量的阿托伐他汀均可使脑缺血再灌注后神经功能缺损症状减轻,脑梗死体积减小。随着再灌注时间的延长保护效果越来越明显,再灌注3 h、6 h保护效果暂无统计学意义(P>0.05),再灌注12 h、24 h各剂量组阿托伐他汀对神经功能评分的减轻,脑梗死体积的减小均具有统计学意义(P<0.05)且阿托伐他汀的保护作用呈剂量依赖性增强。这说明,阿托伐他汀对于脑缺血再灌注损伤具有保护作用,再灌注时间越长,剂量越大保护效果越明显。

3.2 阿托伐他汀对脑缺血再灌注损伤保护作用的机制分析他汀类药物是常规降脂药物,除降脂外,还可减少脂质沉积,延缓动脉粥样硬化的形成,增强斑块稳定性,减少血栓栓塞危险[6];增加一氧化氮合酶(eNOS),增加脑血流量及抗血小板和抗凝等[7-8]。阿托伐他汀的抗炎作用近年来逐渐受到关注。抑制脑缺血再灌注损伤是治疗缺血性脑卒中的关键[9]。炎症反应在脑缺血再灌注损伤过程中起到重要作用,脑缺血诱发炎症反应,炎症反应可激活脑内小胶质细胞,促使小胶质细胞分泌大量炎症介质,进一步加重炎症反应,过度炎症反应可损伤脑组织,导致脑组织坏死,形成梗死灶[10]。本研究重点探讨阿托伐他汀的抗炎作用。

血清hs-CRP被认为是缺血再灌注损伤发生的独立预测指标,且该炎症因子的预测可靠性较高。本研究发现,再灌注3 h,hs-CRP较模型组升高并不明显,再灌注6 h、12 h、24 h,hs-CRP的升高才具有统计学意义,阿托伐他汀对hs-CRP的影响也在6 h、12 h、24 h有统计学意义,表现为可降低hs-CRP且存在剂量依赖性,高剂量组作用最为明显。进一步证明了高剂量阿托伐他汀在治疗脑缺血再灌注方面除了具有明显的降脂作用外,还有较好的抗炎作用。

TNF-α是典型的促炎因子,对炎症反应具有启动作用[11]。首先,TNF-α可引发血管炎性反应,使炎性细胞有机会进入脑组织损伤神经系统。TNF-α还可促进前列环素、血栓烷B2等因子的释放,这些因子可以促凝引发血栓形成,还可减少血管舒张因子,使血管收缩,从而加重脑损伤[12]。阿托伐他汀可以从不同层面降低TNF-α水平[13]。本研究观察到,与假手术组比较,TNF-α于再灌注3 h升高已经具有统计学意义且24 h内一直处于较高水平。与模型组比较,各时间点不同剂量的阿托伐他汀均可降低TNF-α水平,再灌注3 h、6 h不同剂量组对TNF-α的影响无统计学差异,再灌注12 h、24 h随着阿托伐他汀剂量的增加,可以更多的降低血清TNF-α,统计学上呈现剂量依赖性(P<0.05)。即阿托伐他汀剂量越大,降低TNF-α血清水平的作用越明显。说明阿托伐他汀对脑缺血再灌注损伤的保护作用可能与早期抑制了炎症启动因子TNF-α有关,且剂量越高抑制作用越明显。

IL-10是抗炎因子的典型代表,作为一种多功能炎症负调控因子,IL-10可下调其他促炎因子如TNF-α等,抑制炎症反应的扩散,在一定程度上可保护神经细胞免受伤害。本研究发现,阿托伐他汀在防治大鼠缺血再灌注脑损伤过程中,即减少了促炎因子TNF-α的产生,同时也增加了抑炎因子IL-10平,从而在多方面减少缺血再灌注损伤的炎症反应,发挥了神经保护作用。

综上所述,hs-CRP、TNF-α、IL-10均参与了SD大鼠局部脑缺血再灌注损伤的发生和进展,模型组中三者的水平均表现为不同程度地升高,然而TNF-α升高出现得更早,再灌注3 h已经具有统计学差异,而hs-CRP、IL-10在再灌注6 h以后显著升高,阿托伐他汀的早期保护作用主要是因为降低了TNF-α水平,6 h以后对TNF-α、hs-CRP均有抑制作用,同时提升了IL-10水平。且剂量越高对炎症抑制作用越明显。因此,阿托伐他汀预防性使用具有神经保护作用,可减轻脑缺血再灌注损伤,其作用机制可能与影响和调节 hs-CRP、TNF-α、IL-10水平有关。