有机磷农药乐果对家蚕子代生殖功能的影响*

孙曼萁 魏 欣 石 敏 朱 勇

(1.西南大学蚕桑纺织与生物质科学学院，重庆 400715；2.重庆市万州第一中学，重庆 万州 404000)

乐果(Dimethoate)是内吸性有机磷杀虫、杀螨剂，对害虫和螨类有强烈的触杀作用和一定的胃毒作用[1]，其作用机制是抑制昆虫体内的乙酰胆碱酯酶，阻碍神经传导而导致死亡[2]。然而乐果的使用也给农业环境的有益生物带来了污染危害[3]，如对土壤动物呼吸强度具有明显抑制作用[4]。这种污染危害甚至可通过食物链传至整个农业环境的生物链，因而降低生物的多样性。已有的研究明确乐果具有潜在的致畸、致突变和致癌作用[5]，其在生物体内经氧化代谢形成的氧化乐果，会毒害生物的神经，抑制免疫系统功能，导致组织细胞和DNA损伤[6]，用乐果处理小鼠的骨骼肌细胞不仅限制了细胞活力且使细胞凋亡率明显增加[7]。陈建秋等[8]的研究还显示乐果对轮虫有一定的生殖干扰作用，会影响个体发育与性成熟周期和产卵量。

家蚕(BombyxmoriL.)属于鳞翅目的模式昆虫，是重要的经济昆虫[9-10]，其经过漫长的人工选择和驯养，对不良环境因子的抵抗性较弱[11]，生产上常有因为农药污染桑叶使家蚕急性或慢性中毒而造成严重经济损失的事件发生[12-13]。关于有机磷农药对农业环境有益昆虫的生殖毒性备受关注。在本研究中，我们以家蚕作为实验模型来评估乐果对于昆虫的生殖毒性，以利于综合评价蚕区使用乐果杀虫对家蚕等农业环境有益昆虫的危害性[14]。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

选用871和872两个家蚕品种供试，由重庆市蚕业科学研究院提供。蚁蚕孵化收蚁后，1～4龄幼虫正常环境下饲养(25 ℃恒温，相对湿度75%±5%，人工气候箱光周期12L±12D)，每天采摘新鲜桑叶喂养3次。

1.2 试虫处理及取样

将乐果(DMT，40%乳油，重庆市化工集团，生产批号：PD85121-3)用蒸馏水按照一定比例(

1.3 产卵性能和子代孵化率调查

在雌蛾产卵结束后将蛾圈置于25 ℃光照下催青，12 d后调查产卵数、受精卵数和孵化卵数，计算造卵数、产卵数、受精率和孵化率。每一个处理组调查个体数为6头，均做5个生物学重复。

1.4 幼虫生殖腺指数的计算

在子代家蚕发育至5龄5 d，各浓度药液处理组中随机取幼虫(雌、雄各10头)于冰浴条件下解剖其生殖腺并称量。使用以下公式计算精巢和卵巢的脏器系数：生殖腺指数=(器官质量/体质量)×100。

1.5 幼虫生殖腺的组织形态学观察

上述解剖取得的子代家蚕幼虫生殖腺在4 %多聚甲醛中固定24 h后，经乙醇梯度(50%、70%、80%、85%、90%、95%、无水)脱水，经二甲苯与无水乙醇1∶1混合液、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明，石蜡包埋，做连续切片，厚度5 μm，摊片机上40 ℃烘干。再进行二甲苯脱蜡，HE染色，显微镜(Lacia)下观察拍照。

1.6 幼虫生殖腺的抗氧化酶活性检测

根据制造商的说明，使用酶活性测定试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司，江苏苏州)测定子代家蚕幼虫生殖腺中的SOD和CAT酶活性。检测样本制作参照文献[15]的方法。

1.7 抗氧化酶及生殖发育相关基因的实时荧光定量PCR检测

取子代家蚕5龄5 d幼虫的生殖腺提取总RNA。提取的各样品总RNA用核酸分析仪测定其浓度并经1%琼脂糖电泳检测其完整性后，于-80 ℃条件下保存。根据各样品RNA浓度, 反转录合成cDNA，-20 ℃保存备用。引物用Premier5.0软件设计引物, 并送于生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。采用TB GreenTM PremixExTaqTMII试剂盒(TakaRa, 中国)荧光定量PCR检测各样品中与氧化应激相关的cat和sod基因以及与生殖发育相关基因(Ovo、Vg、Sxl-S、Achi-L、Aly、Vlg)的mRNA转录水平, 以家蚕Actin3作为内参，3个重复。基因的表达水平采用2-ΔΔCt法[16]计算, 并利用统计学软件进行单因素方差分析。

表1 家蚕抗氧化酶基因和生殖发育相关基因的引物序列

1.8 数据处理

实验数据采用EXCEL2010和SPSS17.0进行统计学分析，处理组与对照组之间的差异采用Tukey氏检验进行多重比较，以0.05作为显著性水平。依据3次生物学重复试验的数据，进行基因mRNA转录定量检测和酶活性测定的数据分析。

2 结果与分析

2.1 乐果胁迫对家蚕产卵性能和子代孵化率的影响

家蚕5龄幼虫添食不同浓度乐果药液后正常上蔟结茧，羽化后进行杂交(871×872)和自交(871×871)的产卵性能如表2和表3所示。与对照组相比，处理组的产卵数、转色卵数、孵化率、死卵率是随着添食乐果药液浓度的增加而减少。在杂交组中，转色卵数在200 mg/L乐果药液处理组与对照组存在显著差异(P<0.05)；蚕卵孵化率100 mg/L乐果药液处理组与对照组存在显著差异(P<0.05)，200 mg/L乐果药液处理组与对照组存在极显著差异(P<0.01)。在自交组中，100～200 mg/L乐果药液处理组相比对照组，其产卵数、转色卵数和孵化率都出现极显著差异(P<0.01)。因此可以推测，家蚕添食乐果引起的慢性中毒对产卵、受精以及孵化都有一定的影响，且对于自交组的影响更加显著。

表2 家蚕5龄幼虫添食乐果后杂交组(871×872)产卵性状的影响

表3 家蚕5龄幼虫添食乐果后对自交组(871×871)产卵性状的影响

2.2 乐果胁迫对子代家蚕幼虫生殖腺指数的影响

精巢和卵巢是许多生殖毒物的重要靶器官，而性腺指数是胁迫后的毒性测量常用参数之一，可以直观反映化学物质对靶器官的毒性作用。调查结果表明：家蚕5龄幼虫添食不同浓度乐果药液后，杂交组子代幼虫雌雄个体的生殖腺指数较对照组都呈现下降趋势(图1-A)，并且100 mg/L和200 mg/L处理组的雌性生殖腺指数较对照组均表现极显著差异(P<0.01)；自交组子代幼虫生殖腺指数也呈现下降趋势(图1-B)。

比较杂交组和自交组子代的生殖腺指数变化，结果表明非致死剂量的乐果胁迫导致家蚕慢性中毒在自交组引起子代雌性幼虫和雄性幼虫生殖腺指数下降的幅度大于杂交组。

2.3 乐果胁迫对家蚕子代幼虫生殖腺形态的影响

取家蚕子代5龄5 d雄性幼虫的精巢进行组织切片，杂交组和自交组子代雄性幼虫的精巢组织结构观察如图2所示：对照组雄性幼虫的精巢外膜中细胞结构较为完整，精巢内膜向内延伸形成3片隔膜，精巢中的细胞排列整齐，且有精子束出现；各处理组随着乐果药液浓度的提高，子代雄性幼虫的精巢组织的形态结构发生改变，睾丸外膜和包围的结缔组织变薄且出现破碎，高浓度处理组子代雄性幼虫的生精囊可以观察到明显破裂，精细胞排列间隙较大，细胞排列散乱，且腔内出现碎片。

A～D依次为0(CK)、50、100和200 mg·L-1乐果药液处理后杂交组子代5龄雄性幼虫的精巢切片；E～K依次为0(CK)、50、100和200 mg·L-1乐果药液处理后自交组子代5龄雄性幼虫的精巢切片。实线箭头所示为空泡，虚线箭头所示为损伤的精母细胞。

子代5龄5 d雌性幼虫的卵巢组织切片观察如图3所示：对照组的卵巢卵细胞排列较为整齐，且均匀分布于卵巢中；处理组与对照组相比，卵细胞分布不均，且随着乐果胁迫浓度的增大，卵巢中细胞数目也相对减少，细胞间出现空泡。

A～D依次为0(CK)、50、100和200 mg·L-1乐果药液处理后杂交组子代5龄雌性幼虫的卵巢切片；E～K依次为0(CK)、50、100和200 mg·L-1乐果药液处理后自交组子代5龄雌性幼虫的卵巢切片。实线箭头所示为空泡。

通过比较杂交组和自交组子代5龄幼虫生殖腺切片的形态结构，可见在相同浓度乐果处理下，自交组子代比杂交组子代的生殖腺普遍受损程度更大。这一结果表明，以非致死剂量的乐果胁迫导致的慢性中毒会对家蚕子代的生殖腺产生严重影响，且对自交组子代的影响程度更大。

2.4 乐果胁迫对家蚕子代幼虫生殖腺抗氧化酶活性及基因mRNA转录的影响

2.4.1 SOD酶活性及基因mRNA转录变化

SOD能清除超氧阴离子自由基(O2-)，对机体的氧化与抗氧化平衡至关重要。家蚕5龄幼虫添食不同浓度乐果药液后，杂交组子代幼虫生殖腺中的SOD酶活性相较于对照组总体呈现上升趋势(图4-A)。其中，处理组子代雌性幼虫随添食乐果药液浓度的上升SOD酸活性较对照显著升高(P<0.01)，高浓度乐果药液处理组子代幼虫的SOD酶活性较对照组有极显著性差异(P<0.01)，表明此时由乐果胁迫产生的氧化自由基可完全被歧化。实时荧光定量PCR检测各处理组子代幼虫生殖腺中sod基因mRNA转录水平相对于对照组均呈现出下降的趋势(图4-B)。检测到的酶活性和基因mRNA转录的变化不一致，可能是因为SOD酶活性存在不完全依赖基因转录的翻译过程和翻译后蛋白质水平的调控[17]。

从图4-C,D显示的结果还可见：处理组自交子代雌性和雄性幼虫生殖腺的SOD酶活性随添食乐果药液浓度的增加而极显著降低，并且sod基因mRNA转录的趋势与之具有一致性。

A、B为杂交组，C、D为自交组。

2.4.2 CAT酶活性及基因mRNA转录变化

机体内的SOD具有将超氧阴离子自由基转化为H2O2的功能，而CAT可继续分解H2O2，从而降低体内H2O2的浓度，SOD和CAT构成了机体应对外界胁迫的第一道防线[18]。

家蚕5龄幼虫添食不同浓度乐果药液后，在杂交组子代幼虫生殖腺中的CAT酶活性随着添食乐果浓度的增加而先降低后增加(图5-A)。由图5-B可见：处理组杂交组子代雌蚕生殖腺中的cat基因mRNA转录水平呈现先上升(50 mg/L乐果药液处理组)再极显著下调趋势，出现了明显的细胞受害后的基因转录水平回落；而处理组杂交组子代雄蚕生殖腺中的cat基因mRNA转录水平随乐果添食浓度提高呈现先上调再下调(P<0.05)，然后极显著(P<0.01)上升的趋势。

A、B为杂交组，C、D为自交组。

自交组子代幼虫生殖腺中的CAT酶活性变化与杂交组相似，并出现了细胞受害后cat基因转录水平回落(图5-C、D)。推测家蚕经非致死剂量乐果胁迫后，子代幼虫生殖腺中CAT酶活性激活系统受到影响时，能够动员cat基因的上调表达，以缓解乐果慢性中毒对生殖细胞的危害[19]。

2.5 乐果胁迫对家蚕子代幼虫生殖发育相关基因表达的影响

Vg是卵黄蛋白的前体基因，而卵黄蛋白是家蚕胚胎发育的营养来源，Ovo基因与卵巢的发育密切相关，Sxl-S也是作为生殖发育相关基因[20-22]。家蚕5龄幼虫添食乐果药液后，杂交组子代雌性幼虫卵巢生殖发育相关基因Vg、Sxl-S、Ovo的mRNA转录水平在乐果药液处理下，与对照组相比，在50 mg/L呈现上升趋势，在100～200 mg/L均呈现及显著性下降趋势(图6-A～C)，且分别下降44.5%、49.9%、29.9%。在不同浓度乐果药液处理组，自交组子代子雌性幼虫较杂交组相比均呈现极显著性下调(图6-D～F)，即乐果胁迫对自交组子代的生殖发育影响更大。

A～C为杂交组，D～F为自交组。

Achi-L、Aly、Vlg基因与精巢发育的能量代谢和配子分化相关[23]。乐果胁迫后，基因Achi-L、Aly、Vlg在精巢中出现下调表达，随着不同浓度乐果药液的处理，基因的表达出现不同程度的下降。其中经200 mg/L乐果药液处理后的杂交组子代检测到的结果与对照组相比，分别下调表达9.74倍、1.99倍、1.83倍；自交组子代检测到分别下调表达了14.76倍、4.86倍、1.66倍。结果表明，乐果胁迫对家蚕自交子代的蚕卵影响更大。

A～C为杂交组，D～F为自交组。

3 讨 论

有机磷农药常被用作杀虫剂，若操作不慎残留在水果、蔬菜上，就会进入有机体造成伤害[24]，如小鼠[25]、蚯蚓[26]、鲤鱼[27]的研究已经证实了乐果毒性的存在。有报道乐果会导致高萼花臂尾轮虫的种群增长率和净生殖率显著下降[28]。对雄性小鼠的研究发现，长期摄入小剂量乐果会对其生殖系统及其胎鼠发育有一定程度的危害[29]。

抗氧化防御系统是昆虫抗逆机制的一个重要组成部分。机体为保护细胞免受氧化应激的损伤，通过含有的多种酶类清除活性氧以维持体内氧化还原平衡，其中最重要的酶包括 SOD和CAT等[30]。在本实验中，家蚕5龄幼虫添食非致死剂量乐果后，子代幼虫生殖腺中的sod基因mRNA水平下降到很低的水平，这可能会导致没有足够能力清除乐果胁迫产生的超氧阴离子，进而损伤生殖腺组织和细胞，影响子代家蚕的正常生殖生理活动。家蚕5龄幼虫添食高浓度乐果药液后，子代幼虫生殖腺的CAT酶活出现显著上升，这与Shadegan等[31]研究乐果处理鲤鱼后的结论具有一致性。

睾丸是精子生长发育的主要部位，而精子计数、精子活动能力和形态是决定生育力的重要因素[32]。通过对子代家蚕5龄5 d幼虫的精巢组织切片观察发现，乐果会对子代的精子数量和生精囊发育造成影响，这与Jallouli等[33]研究的乐果对雄性小鼠生殖参数的影响结果一致。卵巢是产生卵子的重要部位，是研究农药雌性生殖毒性的常用指标之一[34]。在对子代家蚕5龄5 d幼虫卵巢的组织切片中发现，随着乐果处理浓度的增大，卵巢中细胞数目以及卵细胞受到的影响越大，这与Mahadevaswami等[35]研究结果具有一致性。

Vg是卵黄蛋白的前体基因，而卵黄蛋白是卵生动物胚胎发育时期的主要能源物质[36]。卵子形成过程中卵黄蛋白生成数量对于胚胎发生和早期幼体维持生命所需营养物质的提供有至关重要的作用[37]。薛高旭等[38]和宋作伟等[39]发现BmOvo基因可能参与家蚕卵子的形成，BmOvo下调表达会引起雌蛹体质量、茧层量和雌蛾造卵数均出现下降趋势。Achi-L、Aly、Vlg基因与家蚕精巢发育的能量代谢和配子分化相关。盛洁等[40]研究发现，注射了Achi-si RNA-2的蚕蛾正常交配所产卵中的不受精卵率增加。本实验结果表明，家蚕5龄幼虫添食非致死剂量乐果后，子代雌蚕生殖腺中的Ovo、Vg和Sxl-S基因的mRNA转录水平下降，子代雄蚕生殖腺中的Achi、Aly、Vlg基因mRNA转录水平也出现下调表达，此结果提示家蚕因乐果胁迫导致的慢性中毒，可能对家蚕子代的生殖能力有一定影响。

本研究结果表明：家蚕5龄幼虫添食低浓度乐果药液导致的慢性中毒，可以使家蚕产下卵的孵化率、受精率等出现明显下降，并且会影响到子代的生殖发育，导致子代家蚕生殖腺细胞损伤，且促使子代生殖腺中的过氧化加剧，抗氧化酶活性及其相关基因的mRNA转录水平发生改变，从而引起生殖腺抗氧化系统紊乱，抑制生殖发育相关基因的转录表达。研究结果还表明，家蚕因乐果胁迫慢性中毒对自交组子代生殖发育的影响更为明显，故生产上推广杂交组合也在一定程度上使危害降低。