MMP-9、TNF-、IL-1在无菌性松动界膜组织中的表达及相关性研究*

席向东 陈德胜 杨超 王硕 宋国瑞 张晨 刘子歌

人工关节置换术（artificial joint replacement，AJR）因其较为显著的临床效果而被广大骨性关节炎（osteoarthritis，OA）患者及医生所接受，然而其术后并发症无菌性松动（aseptic loosening，AL）的发生仍然是不容忽视的问题，患者因AL 需要多次进行翻修手术而倍感痛苦[1]。引起AL 的原因有很多，如今被广泛接受的是磨损颗粒介导的骨溶解理论，其主要内容是关节假体产生的磨损颗粒刺激假体周围界膜组织，导致机体固有免疫系统的激活以及一系列级联反应的发生，最终导致炎性因子如肿瘤坏死因子-（tumor necrosis factor- ，TNF- ）、白介素-1（interleukin-1，IL-1）等的大量产生，炎性因子不仅作用于破骨细胞和成骨细胞，造成破骨/成骨的失衡，其自身也参与细胞外基质的降解，最终导致了假体周围骨溶解[2-3]。基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）是近些年研究的新热点，相关研究发现MMP-9 在破骨细胞的分化、成熟过程中发挥着重要作用，除此之外其可以直接参与细胞外基质及假体周围骨质的降解，导致无菌性松动的发生[4-5]。本研究通过观察TNF- 、IL-1 和MMP-9 在关节假体周围界膜组织和骨关节炎滑膜组织中的表达，探索TNF- 、IL-1 和MMP-9 在假体无菌性松动中的作用及相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

对2017年1 月至2018年12 月就诊于宁夏医科大学总医院骨科的住院患者进行分组。将术前诊断为无菌性松动患者且行初次膝关节翻修的患者纳入无菌性松动组，收集术中切除的界膜组织；将术前诊断为骨性关节炎且行初次膝关节置换术的患者纳入骨性关节炎组，收集术中切除的滑膜组织。

无菌性松动组共计20 例，其中男6 例，女14 例，年龄55 ～70 岁。骨性关节炎组共计30 例，其中男8 例，女22例，年龄60 ～75 岁。本研究经本院科研伦理委员会批准（2015-019），所有患者均知情同意。

1.2 主要试剂及仪器

主要试剂：MMP-9 抗体（批号ab38898）、TNF- 抗体（批号ab9739）、IL-1 抗体（批号ab9722）以及辣根酶标记二抗（批号ZB-2301）（Abcam 公司，英国）；HE 染色试剂（银川伟博鑫生物技术有限公司）。主要仪器：YB-6LF 石蜡包埋机、TST1200 包埋专用冷台、YT-7F 型摊片烤片机（湖北省亚光公司）；RM2255 石蜡切片机（Leica 公司，德国）;H6203i 倒置显微镜（Leica 公司，德国）；PIPS-2020 超清晰度病理图文分析系统（Olympus 公司，日本）。

1.3 研究方法

将术中取出的20 例假体周围界膜组织标本及30 例膝骨性关节炎滑膜组织标本制成切片后部分用于HE 染色，镜下观察2 种不同组织的形态性差异。部分切片用于MMP-9、TNF- 和IL-1 的免疫组织化学染色，镜下观察三者的染色情况，黄色或棕黄色为阳性染色，高倍镜下（×400）随机选择5 个视野，使用Image-Pro Plus 6.0 图像处理软件测定三者的平均积分光密度。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0 软件对所得到的数据进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差表示，采用两独立样本t 检验对两组中MMP-9、TNF- 和IL-1 的表达差异进行统计学分析，采用积矩相关性分析对MMP-9、TNF- 和IL-1 在两种不同组织中平均积分光密度值进行分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE 染色结果

无菌性松动组：假体界膜可见大量磨损颗粒填充其中，组织结构混乱、层次不清，并有大量炎性细胞浸润。界膜组织中部分区域可见大量磨损颗粒的聚集，部分区域磨损颗粒较少。骨性关节炎组：滑膜组织结构完整、层次清晰，呈现为慢性炎症的表现，整个滑膜组织可见炎性细胞的填充，滑膜组织部分区域可见明显的新生血管增生并聚集的表现。

图1 两组HE 染色（×100）：A.无菌性松动组；B.骨性关节炎组

2.2 两组中MMP-9、TNF- 和IL-1 的平均积分光密度

无菌性松动组中平均积分光密度MMP-9 为（0.4129±0.0561）、TNF- 为（0.3099±0.0597）、IL-1 为（0.2482±0.0392），骨性关节炎组中平均积分光密度MMP-9 为（0.3882±0.0822）、TNF-为（0.2928±0.1345）、IL-1 为（0.2263±0.0880）。两组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具体数据见表1。

表1 MMP-9、TNF- 和IL-1 在两组中的平均积分光密度比较

2.3 两组中TNF- 、IL-1 和MMP-9 的Pearson 相关性分析

无菌性松动组中MMP-9 和TNF- 相关系数r=0.916，P＜0.01，MMP-9 和IL-1 相关系数r=0.606，P＜0.01，差异均有统计学意义，且呈正相关性（见表2）。骨性关节炎组中，MMP-9 和TNF- 相关系数r=0.830，P＜0.01，MMP-9 和IL-1相关系数r=0.734，P＜0.01，差异均有统计学意义，且呈正相关性（见表3）。

表2 无菌性松动组中TNF- /IL-1 与MMP-9 的Pearson相关性分析

表3 骨性关节炎组中TNF- /IL-1 与MMP-9 的Pearson相关性分析

3 讨论

至今OA 的发病机制仍不明确，遗传、年龄、肥胖等多种因素均可以影响其进展[7]，对于关节置换术后假体无菌性松动的研究也有很多，目前以磨损颗粒介导的骨溶解理论被广泛接受，其主要认为关节假体在长期的使用过程中产生的磨损颗粒介导了一系列炎症的级联反应，从而导致假体无菌性松动的发生[8]。

引起炎症性骨溶解的原因有很多，但不管病因和细胞环境如何，破骨细胞都是骨降解细胞。炎性细胞因子对破骨细胞形成和功能的影响是促进局灶性骨溶解的重要因素之一，免疫细胞及其产物影响破骨细胞、成骨细胞和骨细胞的活动并决定骨量和强度。20 世纪70年代，人们就发现了免疫系统与骨骼系统之间的这种关系，受刺激的单核细胞可以产生分解代谢的骨吸收因子并证实该因子为IL-1[9-10]。在生理条件下，成骨细胞表达并释放RANKL，和破骨细胞前体细胞表面的RANK 结合后促进了破骨细胞的分化[11]，高剂量的RANKL 具有破骨作用，而低剂量的RANKL 可能会促进骨形成[12]。RANKL 通过肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）激活RANK，RANKL/RANK 信号传导诱导MAPK 激酶和NF- B，最终激活破骨细胞转录因子NFATc1[13-15]。IL-1 大量存在于炎性组织中，可诱导并与TNF- 结合，促进炎症性骨溶解[16]。在炎性组织中，TNF- 可增强滑膜成纤维细胞和巨噬细胞分泌IL-1，IL-1 反过来刺激RANK 和RANK 及其自身受体的表达[17]。

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是主要负责切割细胞外基质（extracellular matrix，ECM）等相关蛋白质的蛋白酶家族，并产生生物活性分子[18]。MMP-9是破骨细胞表达和分泌最多的MMP，但其功能尚不完全清楚，破骨细胞中的RANKL 和维生素D 可以调节MMP-9 的表达。MMP-9 通过作用于相关底物将无活性的前体TNF-转化为活性细胞因子，促进破骨细胞的生成和存活。除此之外，MMP-9 降解IL-1 并促进破骨细胞融合、存活及其活性[19-21]。炎性细胞因子TNF- 、IL-1、MMP-9 彼此之间相互作用、相互影响，并通过相关的信号通路作用于破骨细胞及其他骨细胞的表达，最终引起骨溶解。

磨损颗粒通过刺激界膜组织中的细胞（主要为巨噬细胞），使炎性细胞因子TNF- 、IL-1 等的表达增加，并激活不同信号通路导致破骨/成骨失衡，最终发生骨溶解和无菌性松动，参与假体无菌性松动的信号通路有RANKL/RANK/OPG 信号通路、Wnt 信号通路、丝裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路等[22-23]。赵建宁等[24]通过建立小鼠模型，采用ELISA 方法检测TNF-

在对照组和CoCrMo 组的分泌水平，结果显示CoCrMo 组中TNF- 的分泌水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。金群华等[25]研究发现，基质金属蛋白酶诱导因子的蛋白及mRNA 在无菌性松动人工髋关节界膜组织中的表达明显高于股骨颈骨折后髋关节滑膜组织（P＜0.05）。马建兵等[26]研究进一步发现聚乙烯微粒较其他微粒（如金属微粒、水泥微粒等）刺激性更强，刺激巨噬细胞释放更多的TNF- ，导致骨溶解加剧。

本次研究纳入20 例无菌性松动膝关节假体界膜组织标本（无菌性松动组）和30 例骨性关节炎滑膜组织标本（骨性关节炎组），HE 染色可见无菌性松动组中较为明显的炎性表现，骨性关节炎组中亦可见慢性炎症表现，表明磨损颗粒促进了炎症的表达。同时对两组中的TNF- 、IL-1 和MMP-9 的表达差异和相关性进行统计分析，结果发现无菌性松动组中TNF- 、IL-1 和MMP-9 的表达稍高于骨关节炎组，但是差异无统计学意义（P＞0.05），临床上大多数无菌性松动患者常常发生在术后早期并行手术治疗，所以患者往往感觉关节疼痛、不稳的时候即入院复查，这也避免了假体的进一步磨损，这也可能是本次实验中TNF- 、IL-1 和MMP-9 的表达无明显差异的主要原因。对于TNF- 和MMP-9，以及IL-1 和MMP-9 之间的相关性研究前面已做阐述，众多研究也都证明了其存在相关性[27-28]。本次研究中也对TNF- 和MMP-9，以及IL-1 和MMP-9 行Pearson 相关性分析，结果显示无论在无菌性松动组或骨性关节炎组中炎性因子TNF- 和IL-1 与MMP-9 差异均有统计学意义，且均呈正相关性，磨损颗粒刺激了可能促进了TNF- 和IL-1 的表达，但未在不同组织中引起统计学差异。所以通过减少磨损颗粒的刺激以及阻断炎性因子和MMP-9 之间的相关性就可能减缓无菌性松动或者骨性关节炎的发展进程。