NIH 稀毛小鼠认知情绪等行为学相关特性的测定

冀中豪，于小亚，任文陟，陈 健，胡进平*

1.长治医学院基础医学部，山西长治 046000；2.吉林省科技创新平台管理中心，吉林长春 130062；3.吉林大学动物科学学院，吉林长春 130062；

实验小鼠是最常使用的一种模式动物，在生命科学和医学研究中发挥着巨大的作用。NIH 稀毛小鼠是被毛异常的自发突变鼠，其背景品系是封闭群NIH 小鼠，为常染色体隐性遗传。毛囊的生长发育包括形态发生和周期循环两个阶段，目前研究发现的多种被毛突变小鼠模型主要表现为周期循环阶段的异常，例如典型的Hr 基因突变小鼠表现为渐进性脱毛，而NIH 稀毛小鼠属于形态发生期存在异常表现为出生后一直保持稀毛甚至无毛的状态。前期研究中对NIH 稀毛小鼠的皮肤结构和免疫相关的生物学特性进行了观察和测定，发现NIH 稀毛小鼠表皮层增厚、毛发周期转换异常，单增李斯特杆菌感染实验表明相较于NIH 小鼠其免疫力降低。

使用最广泛的一种被毛异常小鼠是裸小鼠，其胸腺缺失T 细胞缺陷而导致的免疫低下使其适用于肿瘤、免疫和感染等相关方向的研究。裸小鼠最显著的表型是皮肤被毛异常，关注于这一表型可以将裸小鼠用于皮肤或毛发发育相关的研究，但是如果错失了其胸腺缺失免疫缺陷这一表型，将是对这一模型资源的极大浪费。因此，在本研究中，我们将通过生理生化指标的测定和行为学相关的实验来分析NIH 稀毛小鼠的相关生物学特性，完善其基础信息，为实验动物资源的开发和模型的应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

6 ～8 周龄的NIH 稀毛小鼠由吉林大学实验动物中心提供，SPF 级6 ～8 周龄的NIH 小鼠购于长春生物制品有限公司，所有动物均饲养于吉林大学实验动物中心，自由采食饮水，光暗周期12 h/12 h，所有操作符合实验动物伦理福利规范的要求，具体实验动物的分组和数量见各部分实验设计，NIH 小鼠以NIH 表示，NIH 稀毛小鼠以HL 表示。

1.2 主要试剂和仪器

75%乙醇、英雄牌黑墨水、桂龙牌黄帽带分离胶促凝血液采集管、富士干式生化仪、超净工作台、离心机、行为学配套设备及分析软件。

1.3 血清生化指标的测定

8周龄雄性NIH稀毛小鼠和NIH小鼠各10只(雄性小鼠适应性强，状态稳定，自身激素影响较小，常用于脏器功能性实验)，摘眼球采血收集于黄帽采集管，4 000 rpm 离心15 min 收集上清液，使用生化仪上机检测生化21 项指标。

1.4 开放旷场实验

在60 cm（长）× 60 cm（宽）× 40 cm（高）的非透明无毒材质旷场中进行试验。整个场地划分为4×4 共16 个正方形小块，中间4 个正方形区域为内区。开始摄像，选择一个壁，然后轻轻地将鼠面壁由中点位置放入，记录5 min 的运动轨迹。随后使用蒸馏水和75%乙醇擦拭清洁实验场地，防止排泄物及残留气味影响后续实验。重复以上步骤，直到所有小鼠完成实验。观察记录三个指标：总的运动距离、内区占比、内区穿越次数。

1.5 新物体识别实验

实验所用场地同上，新物体识别实验包含三个部分：第一部分习惯场地（1.4 中已完成），第二部分熟悉旧物体，第三部分测试新物体识别情况。第二部分实验使用5 cm（长）×5 cm（宽）×8 cm（高）的两个红色正方体积木作为旧物体，两个积木通过双面胶固定离壁5 cm 处，面向壁侧中央放入小鼠探索活动5 min。第二部分实验结束后3 h 进行第三部分，实验时将其中一块红色正方体积木更换为黄色球体积木，直径5 cm，同样探索活动5 min，记录小鼠探索新物体和旧物体的实验占比。实验设置为以小鼠鼻尖距物体2 cm 内视为对物体有探索行为。

1.6 高架十字迷宫实验

在所有小鼠进行新物体识别实验的后一天进行高架十字迷宫试验，按照步骤1.6 所述清洁仪器。注：高架迷宫的结构为“十”形。它有两个张开的手臂（30 cm×5 cm×0.5 cm），彼此交叉，垂直于两个闭合的手臂（30 cm×5 cm×16 cm），中间有一个平台（5 cm×5 cm×0.5 cm）。迷宫高出地面40 cm。将小鼠放开臂和闭臂的交界处，记录5 min的探索行为。观察记录小鼠在张开臂（open）和闭合臂（close）中的时间，open/close 表示焦虑程度，记录活动轨迹图。

1.7 Morris 水迷宫实验

实验所用场地为直径120 cm、高60 cm 的圆形水池，等分为四个象限。实验前一天清洗水池并注水，加入6 mL 黑墨水增强小鼠与背景反差，设置仪器参数。首先进行可视化平台实验，即目标平台高于水面在小鼠视野范围内，该实验结果将反应小鼠的视力和游动速度对后续实验的影响；其次进行定向航行实验训练小鼠寻找目标平台，此时目标平台在水下1 cm 处，小鼠无法直接观察到，实验结果反应小鼠的学习能力，该部分实验为期4 d，每天训练4 次，每次由不同象限入水；最后进行空间探索实验，将目标平台撤离，小鼠由对侧象限入水，观察小鼠在目标平台所在象限的停留时间，穿梭进入目标平台的次数等，实验结果反应小鼠的空间记忆能力。

1.8 统计分析

使用Graphpad Prism 软件（8.2.1 版本）进行数据的统计分析和绘图展示，实验结果以平均值±标准差表示，组间比较采用双尾T 检验，*表示p＜0.05、**表示p＜0.01。

2 结果

2.1 NIH 稀毛小鼠血清生化指标的检测结果

血清生化指标主要包括肝功能、肾功能、血脂、血糖等指标，能够反应肝脏肾脏的基本状态。检测结果表明，相较于NIH 小鼠，NIH 稀毛小鼠肝功相关的的ALT、AST 和D-BIL 显著升高（p＜0.05），CHE、TP 和ALB 显著升高（p＜0.0001），ALP 显著降低（p＜0.01）；肾功相关的BUN 降低（p＜0.05），AU 升 高（p＜0.01）；血 脂 相 关 的TG 显 著 升 高（p＜0.05）。结果指示NIH 稀毛小鼠的肝功和肾功存在异常。相关结果见表1。

表1 8 周龄雄性NIH 稀毛小鼠和NIH 小鼠血清生化指标

2.2 开放旷场实验结果

旷场实验通过观察小鼠在场地中间区域和外周曲线的活动情况，基于运动距离，穿梭次数和停留时间等指标来评价受试物在新异环境中的活动量和探索情况。5 min 的旷场实验结果表明，NIH 稀毛小鼠（HL）与NIH 小鼠（NIH）在活动量上无明显区别（图1A）；但是通过对小鼠在中央区域的活动时间（图1B）和穿入次数（图1C）进行统计发现，NIH 稀毛小鼠相较于NIH 小鼠具有更强的探索行为。

2.3 新物体识别实验和高架十字迷宫实验结果

新物体识别实验通过设置颜色及性状各异的两类探索物，基于小鼠对新异食物的探索偏好度来反应小鼠的短时记忆。实验结果表明，在5 min 的测试时间中，两种小鼠的新物体识别能力无明显区别（图2A）；高架十字迷宫则是通过设置敞臂和开臂两种探索区域来测定小鼠的焦虑样表现。实验结果表明，NIH 稀毛小鼠有明显的焦虑样行为，具体表现为开闭壁探索比例显著低于NIH 小鼠（p＜0.0001）（图2B），运动轨迹图直接展示了小鼠的探索活动行为（图2C、D）。

图1 OFT 实验结果

图2 NOR 实验和EPM 实验结果

2.4 Morris 水迷宫实验结果

Morris 水迷宫实验包含两个阶段的内容，能够对动物的学习能力和空间记忆能力进行评价。首先将目标平台置于水面之上进行可视化平台测试，结果表明两组小鼠的视力正常并且游动速度不会影响实验结果（图3A）；为期4 d 的定向航行实验训练小鼠寻找隐藏的平台，结果表明随着训练的进行两组小鼠的逃避潜伏期逐渐缩短，但两组之间无明显区别（图3）；图3C、D 展示了训练第4 天两组小鼠的运动轨迹。

图3 Morris 水迷宫定向航行实验

第5 天撤去隐藏平台进行空间探索实验，小鼠由目标象限对侧入水（图中右上角圆点表示入水点，下半区域圆点表示实验结束时小鼠的停留位置），在测试时间60 s 中NIH 稀毛小鼠进入目标象限的次数显著多于NIH 小鼠（图4A），在目标象限的停留时间比例也显著高于NIH 小鼠（图4B），表明NIH 稀毛小鼠的空间记忆能力强于NIH 小鼠。图4C、D 展示两组小鼠的运动轨迹。

图4 Morris 水迷宫空间探索实验

3 讨论

小鼠模型是生命科学和医学研究中最常使用的模型。被毛突变小鼠是其中的一种，在皮肤光老化、毛发生长周期的调控机制、肿瘤、感染和免疫方面有着广泛的应用。NIH 稀毛小鼠是一种自发性的被毛突变鼠，前期的研究表明其毛囊形态发生和周期循环存在异常，取雌性42 日龄NIH 稀毛小鼠和NIH 小鼠的背部皮肤进行了转录组测序，构建了差异基因表达谱，NIH 稀毛小鼠可以用于毛囊发育相关的研究。皮肤是机体免疫的第一道屏障，毛囊的异常影响皮肤稳态，通过单增李斯特杆菌感染实验对NIH 稀毛小鼠的先天免疫能力进行了测定，评估了了肠道菌群对实验结果的影响，表明NIH 稀毛小鼠有用于免疫、肿瘤研究的潜力。

为了进一步完善NIH 稀毛小鼠的生物学特性，加深对这一新型实验动物模型的认识，在本研究中对NIH 稀毛小鼠的生理生化指标和行为学相关的生物学特性进行了测定和分析。结果表明，NIH 稀毛小鼠的肝功异常，可以尝试将NIH 稀毛小鼠用于肝炎、肝损伤模型的研究。通过旷场实验、新物体识别实验、高架十字迷宫实验和Morris 水迷宫实验对NIH 稀毛小鼠的活动量、记忆、探索和焦虑行为进行了测定分析，结果表明NIH 稀毛小鼠的空间记忆能力增强，探索行为增强但是呈现出对高悬开臂的恐惧样的焦虑行为，NIH 稀毛小鼠在行为学方面的特性提示其可能适合应用于记忆焦虑相关的药理或毒理实验。

此外，NIH 稀毛小鼠是一种自发突变鼠，遗传学实验表明这是一种常染色体单基因隐性突变，通过全基因组重测序将突变基因定位到了14 号染色体，对NIH 稀毛小鼠表型的分析将揭示突变基因的潜在功能，为后期突变基因的精细定位和验证提供了有利支撑。