五大连池碧泊沉积物细菌多样性及其与环境因子的关系

战栎，王伟东，晏磊

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319）

淡水湖泊中蕴含着大量的微生物资源，微生物在淡水湖泊中主要受气候变化的影响、生物地球化学循环的调控，微生物对于维持生态系统稳定起着非常重要的作用[1]。相比于海洋微生物，微生物在淡水沉积物中通常对光照、pH、温度、氧化还原电位、碳、氮、金属离子等耐受幅度相对较窄，并且微生物对气候的变化和人为的扰动更为敏感，即便是很小的环境改变也能够显著的影响湖泊水体的理化性质，进而使水体微生物生态系统落组成和结构发生变化，从而影响水生生态[2]。微生物的细菌群落作为一些水生微生物的食物网中的重要组成部分，并且在淡水湖生态系统中的营养循环和物质转化过程中都发挥着重要作用[3]。由于淡水湖泊通常在灌木丛附近，很小的外界气候幅波动都会引起灌木丛线的迁移，同时会伴随着一些营养盐、溶解有机碳等营养物质进入湖泊从而引起关键环境因子发生变化，甚至可能会引起湖泊生态系统发生显著的变化[4]。因此研究细菌群落时空分布格局的形成机制及其对环境变化的响应有助于揭示湖泊生态系统功能的变化，最终预测生态系统对当前以及未来环境变化的响应。目前，大量的研究表明在湖泊水体中，细菌群落的组成和多样性受到环境因素的影响，如温度、pH、一些营养物质等。虽然针对环境变化和时空变异对水体细菌群落结构影响的相对重要性已有初步研究，但是就极端环境的淡水湖泊中细菌群落时空格局维持机制的研究还较少[5]。

五大连池位于黑龙江省西北部，地处小兴安岭山地向松嫩平原过渡的地带，总面积约为1 060 km2[6]。温泊位于火山区中心地带的老黑山南侧熔岩台地，是五大连池最有特色的湖泊，水源为多个大小不同的自涌泉，泉水由北向南依次形成丽泊、碧泊、晶泊三个小型湖泊。温泊全长约1.8 km，平均水深0.8 m，最深处2 m 左右，丽泊为源头湖，碧泊面积最大。温泊为五大连池唯一的不冻湖，水体温度常年保持在4～14 ℃，温泊中铁浓度是五大连池所有水体中含水量最高，并且含有大量营养物质供给菌体生长。属于微小尺度（1～106m3），而目前对于微生物生态系统的研究多数集中在较小尺度，对微小尺度的微生物生态研究较少[7-8]。

基于此，实验研究拟以五大连池碧泊沉积物中细菌为研究对象，通过高通量测序技术、沉积物理化因子分析试图：（1）分析碧泊沉积物中微生物群落特征；（2）研究碧泊沉积物中环境因子同细菌的相关性。这些问题的解决为研究碧泊沉积物中细菌的分布特征，从微生物的角度揭示不同影响因素对碧泊沉积物的扰动，为碧泊沉积物的环境保护提供重要的资料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

硫酸亚铁铵；37% 盐酸；98%硫酸；乙酸钠；冰乙酸；盐酸羟胺；林菲洛琳；氢氧化钠；高氯酸；邻二氮菲；无水乙醇；硫酸高铁铵；磺基水杨酸；硝酸钾；引物338F，806R（10D，上海生物工程有限公司）；可溶性总铁测定试剂盒（广东还凯微生物科技有限公司）；2×Taq PCR Master Mix（北京全式金生物科技有限公司）；dd H2O；琼脂糖；DNA 提取试剂盒。

1.1.2 仪器

氧化还原测试仪（PHB-4，上海仪电科学仪器股份有限公司）；分光光度计（A003，上海菁华科技仪器有限公司）；电泳仪（YJ300C，北京君意东方电泳设备有限公司）；碳氮元素分析仪（mulyi N/2000 型，耶拿，德国）；PCR 仪（2720 型，Applied Biosystems，美国）；Miseq 系统（2500 型，Illumina，英国）。

1.2 方法

1.2.1 样品的采集

温泊位于五大连池火山区域，中国北部黑龙江省（N 48°35′6.74"，E 126°17′14.15"）。它由碧泊、丽泊、晶泊三个小湖泊组成，这些小湖泊由一条小溪连接，大部分水来自分布在丽泊湖底部的26 个左右的泉水。温泊湖全长1.8 km，平均水深0.8 m，最深水深2 m。碧泊和丽泊湖分别是三个湖泊中最大和最小的。2017 年10 月（秋季）对碧泊沉积物进行了采样。在碧泊沉积物中取3 个不同的位置作为大采样位点，每个大采样点由同一经纬度的5 个小采样位点等比例混合组成，混合后的样品装入经过灭菌处理的采样瓶中。物理化学参数的样品分析储存在4 ℃，分子生物学分析的样品储存在-20 ℃，所有储存的样品应避免阳光直射。

1.2.2 环境因子分析

以2.5∶1 的水泥比过滤取上清液，采用带玻璃电极的数字pH 计测量沉积物pH 值。氧化还原测试仪测量氧化还原电位，总铁用总铁试剂盒测定，Fe（II）和Fe（III）的浓度分别用邻菲罗啉分光光度法和磺胺水杨酸法测定。TOC 和TON 分别用元素分析仪和过硫酸钾消解-紫外分光光度法测定。

1.2.3 碧泊沉积物细菌多样性分析

碧泊沉积物样品DNA 的提取：将沉积物样品用细菌DNA 提取试剂盒直接进行DNA 提取，将提取的DNA 直接作为PCR 模版。PCR 的正向引物为338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′），反向引物为806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′），反应体系：12.5 μL 的2×Taq PCR Master Mix，上下引物各1 μL，1 μL 的菌液模版，用无菌水补至25 μL。PCR 扩增的条件为：95 ℃预变性10 min；94 ℃，40 s、55 ℃，60 s、72 ℃，55 s，30 个循环；最后70 ℃延伸10 min。PCR 产物经胶回收纯化，检测其浓度和条带清晰度。检测合格的样品进行高通量测序，扩增细菌的16S rDNA V3+V4 区片段，高通量测序在北京百迈克生物科技有限公司完成。

1.2.4 碧泊沉积物细菌多样性同环境因子的关系

实验采用全随机分组设计，三次重复进行细菌多样性的分析。运用CANOCO 5.0 软件对环境因子、群落和环境因子之前进行主成成分分析和冗余分析。

2 结果与分析

2.1 碧泊沉积物环境因子的测定结果

碧泊沉积物pH、Eh、ITN、Fe（II）、Fe（III）、TOC 和TON 环境因子的测定结果为：pH 为5.15，偏酸性；其Eh 测定结果为31 mV；其STI 含量为13.05 mg·g-1；Fe（II）含量为8.84 mg·g-1；Fe（III）含量为5.68 mg·g-1；TOC 含量为8.26%；TON 含量为7.18 mg·g-1。

2.2 碧泊沉积物中MTB 多样性分析

2.2.1 Alpha 多样性指数统计

Alpha 多样性是指在细菌在一个特定的区域或生态系统中的多样性，它即可以反映物种丰富度也可以反映物种均匀度。Alpha 多样性主要与物种种类数目，即丰富度；多样性，群落中个体分配上的均匀性有关。微生物群落的丰富度指数主要指Chao1 和ACE 指数。群落多样性指数，主要指Shannon 和Simpson 指数。碧泊沉积物中共获得135 个OTU，ACE 指数为4 261，Chao1 指数为4 223。而群落多样性指数中，Shannon 指数为5.918 9，Simpson 指数为0.036 8。图1 为碧泊沉积物16S rDNA 高通量测序的稀释曲线图，从图中可以看出稀释曲线已趋于平稳，表明该沉积物样品测序合理，可以反映基本情况。

图1 碧泊沉积物16S rDNA 基因的稀释曲线Fig.1 Dilution curve of 16S rDNA gene in Bibo sediments

2.2.2 碧泊沉积物中细菌的多样性组成

通过对碧泊沉积物中细菌群落组成在OTU 分类水平上的统计分析，找出碧泊沉积物中细菌在OTU分类水平中占优势的群落，结果如图2。结果表明，碧泊沉积物共获得135 个OTU 分布，其中不动杆菌属（18.76%）、马赛菌属（2.46%）、铁氧化属（1.51%）、铜绿假单胞菌属（1.47%）、百欧博伟属（1.16%）、地杆菌属（1.08%）、慢生根瘤菌属（1.07%）属于变形菌门，Chryseobacterium sp.（1.72%）属于拟杆菌门。然而碧泊沉积物中含有大量的未培养和未鉴定的细菌，这进一步说明了样品中细菌含量丰富。

图2 碧泊沉积物的群落组成（a：门水平；b：属水平）Fig.2 Community composition of Bibo sediments（a：phylum level；b：genus level）

2.3 碧泊沉积物中细菌多样性同环境因子的关系

采用RDA 分析碧泊沉积物中细菌的多样性同环境因子的关系结果如图3 所示。由图可知，酸杆菌门Acdiobacteria、螺旋体菌门Saccharibacteria、芽单胞菌门Gemmatimonadetes、变形菌门Proteobacteria和Eh、STI 极显著呈正相关，伊格纳维门Ignavibacteriae、放线菌门Actinbacteria 与Eh、STI 呈正相关但不显著。综上所述，Eh 对碧泊沉积物中细菌多样性影响较为显著，而STI 对碧泊沉积物多样性的影响仅次于Eh。

图3 碧泊沉积物细菌多样性与环境因子的RDA 分析Fig.3 RDA analysis of bacterial diversity and environmental factors in Bibo sediments

3 讨论

对五大连池碧泊沉积物中的7 个环境因子进行测定，通过氧化还原电位和pH 的测定结果显示碧泊沉积物中氧化还原电位和pH 值与五大连池其他湖泊存在差异，其主要原因可能是由于碧泊湖泊属于半封闭性水体，其水体与水体之间交换速度较为缓慢，滞留时间也较长，所以水中溶解氧含量逐渐减少从而大幅度降低了湖泊本身的自净能力[6]。由于人类活动或者其他因素等产生的外源污染物进入湖泊后与水体本身的存在污染物累积从而影响湖泊细菌菌群的正常代谢，导致厌氧或者兼性厌氧细菌代谢产物逐渐扩散到水体中，进而导致水体中氧化还原电位和pH值同其他湖泊位点存在差异[9]。碧泊沉积物中STI、Fe（II）、Fe（III）含量较湖泊中其他湖泊沉积物样品含量较高，可能是由于其所处于位于火山区中心地带的老黑山南侧熔岩台地的高磁区域所致。而TOC 和TON含量也较其他湖泊沉积物样品含量较高，其主要原因可能是由于碧泊沉积物周围有大面积的灌木丛，从而导致总有机碳和总有机氮含量偏高[10]。

碧泊湖泊属于浅水湖泊，其沉积物中含量最高的细菌主要为变形菌门。变形菌为碧泊湖泊中细菌的最有优势的菌群，且碧泊湖泊中所属于变形菌的微生物主要为不动杆菌属（18.76%）、马赛菌属（2.46%）、铁氧化属（1.51%）、假单胞菌属（1.47%），这些微生物都是在淡水湖泊沉积物中较为常见的菌属[11]。对五大连池碧泊沉积物的细菌多样性研究中，观察到沉积物中细菌最丰富的细菌门类包括变形菌门和拟杆菌门，且该结果与实验室在五大连池不同湖泊沉积物中得出的结果基本一致[6，12]。由此可见，碧泊沉积物中细菌组成结构地域差异不十分明显。除此之外，碧泊沉积物中含有大量的与铁还原菌和铁氧化菌相关的菌属，如不动杆菌属，假单胞菌属，地杆菌属等，这也可能是其独特的地理位置所致的。地杆菌与厌氧粘细菌在碧泊沉积物中也为丰度相对较高的细菌，这一类细菌有较高的重金属还原能力，其主要分布于厌氧环境，并在湖泊中能够参于一些变价重金属的氧化还原、部分放射性金属元素的稳定化以及一些有机卤化物的生物代谢过程[13-14]。由于目前金属污染较严重的淡水湖泊沉积物研究也发现地杆菌属和粘细菌属在该类湖泊底泥中种类及丰度都十分丰富，研究结果可看出与之类似，这也表明了还原细菌可能会存在于金属浓度较高的环境中，碧泊沉积物也可能受到了一定程度的重金属污染[15-16]。

细菌的群落组成主要由两个影响因子组成：内部环境因子和外部环境因子。其中内部环境因子主要指食物网中生物之间相互作用以及物种本身之间的影响因子，而外部环境因子主要是指环境温度、氧化还原电位、pH、总碳、总氮、重金属离子浓度等[17]。目前认为在沉积物中停留时间长的细菌群落主要受一些内部环境因子的影响。研究通过RDA 分析主要细菌群落与外部环境因子的关系，分析结果表明不同的环境因子对不同的细菌群落有着不同影响，而Eh和STI 对碧泊沉积物中细菌多样性影响较为显著。

近年来，湖泊中的细菌多样性及其分布情况有着系统的研究，不同的环境因子对细菌的组成及其丰度有着很大的影响。影响湖泊沉积物中细菌多样性的因素有很多，比如其所处的地理位置、人类活动、物种间的相互影响以及环境特异性都可能导致湖泊沉积物中细菌多样性的变化[18]。因此，在未来的研究中，一定要综合考虑外在影响因子和内在影响因子对细菌群落多样性的影响，更加全面的分析细菌多样性与环境因子的关系[19-20]。

4 结论

通过对碧泊沉积物中细菌多样性及其与环境因子的关系进行研究，得出：

（1）碧泊沉积物主要由变形菌门和拟杆菌门的细菌组成，其优势菌群为变形菌门，所占比例为60.23%。基于高通量数据结果表明，碧泊沉积物中具有较丰富的细菌多样性。

（2）通过碧泊沉积物中细菌多样性同环境因子的关系可知，Eh 对碧泊沉积物中细菌多样性影响较为显著，而STI 对碧泊沉积物多样性的影响仅次于Eh。