不同快菜品系萌发期耐热指标筛选及耐热性评价

庞强强，孙晓东，蔡兴来，张 文，周 曼

(海南省农业科学院 蔬菜研究所/海南省蔬菜生物学重点实验室/海南省瓜菜育种工程技术研究中心,海南 海口 571100)

快菜为早熟不结球大白菜，食用部分主要为幼苗或半成株，是世界上广泛栽培和食用的叶菜类蔬菜[1]。其原产中国，不耐高温，高温下容易烂种，出苗率低，死苗多[2]，高于25 ℃时植株生长就会受阻，造成产量低，品质差，甚至死亡。随着全球气候变暖，高温已成为全世界农业生产中面临的主要环境影响因素。在实际生产和研究中，通过选育耐热品种和采用合适栽培技术来提高蔬菜产量与品质。

萌发期是植物生长最为关键的阶段，同时也是植物生长过程中最薄弱的一个环节，该环节与幼苗成活率、作物产量及产品品质密切相关[3]。因此，研究蔬菜种子在高温下的萌发特性及萌发期的耐热性鉴定，是其全生育期耐热性研究的重要内容。前人研究发现，抗氧化酶[4]、细胞膜透性[5]、内源激素[6]、叶片组织结构[7]等与快菜耐热性密切相关，同时筛选出多个与快菜耐热性有关的形态及生理生化指标，如苗期叶柄长度、叶面积大小[8]，脯氨酸和叶绿素a含量[9]，游离氨基酸和总糖相对含量[10]等，但因各试验处理方式方法不同，所得鉴定指标各异，而且多以单项指标来衡量，无法全面客观地反映其耐热能力。

目前在叶菜类蔬菜耐热性评价上较为公认的方法是通过观察高温环境下叶片外部形态变化，即统计热害指数来判断植株的耐热性强弱[8,11]。研究快菜种子的发芽特性是培育耐热品种的重要基础，可有效解决播种及幼苗形成与生长的问题。迄今为止，国内外有关快菜种子萌发期耐热种质资源筛选及鉴定指标的研究尚鲜见报道，有关快菜模拟高温胁迫最适温度也未见研究。为此，本研究首先以耐热性不同的6份快菜品系为材料，通过设置不同温度进行萌发期模拟高温胁迫，测定不同温度下快菜品系的萌发指标，分析不同快菜品系的萌发差异，来确定快菜萌发期模拟高温胁迫的最适温度；然后以筛选出的温度进行高温胁迫处理，对38份快菜品系的发芽指标和根芽指标进行测定与评价，通过对各指标耐热系数进行相关性分析、主成分分析、隶属函数分析、逐步回归分析和聚类分析，筛选出耐热性强的快菜品系，以及易测定的与其萌发期耐热性密切相关的指标，并将萌发期室内鉴定结果与田间自然鉴定结果进行比较，以期为快菜耐热育种、开展耐热机理和耐热调控缓解机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为38份快菜品系，其中31份为收集的国内外快菜品种，7份为自主创制的自交系(表1)。

表1 参试快菜品系名称和来源Table 1 Names and origins of seedling-edible Chinese cabbage lines

试验于2018-2019年在海南省农业科学院蔬菜研究所永发试验基地和海南省蔬菜生物学重点实验室进行。

1.2 高温胁迫适宜温度的确定

以耐热性不同的6份快菜品系为材料，分别是耐热品系B18、B33，不耐热品系B11、B15，中等耐热品系B2、B36。每个品系选取100粒优质、饱满、大小一致的种子，用去离子水浸泡2 h后，均匀摆放于铺有双层滤纸的培养皿中，盖上培养皿，分别放入昼/夜温度分别为25/18 ℃(对照)、35/25 ℃、37/27 ℃、42/29 ℃的培养箱中，光周期为光照16 h/黑暗8 h，处理期间保持滤纸湿润，每个品系设3次重复。根据种子萌发情况来筛选适宜的高温胁迫处理温度。

1.3 萌发期耐热指标筛选及耐热性评价

以38份快菜品系为材料，对照和高温胁迫处理方法同1.2节，以筛选得到的温度作为胁迫温度，25/18 ℃作为对照，每个品系设3次重复。测定发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、芽长、芽粗、芽鲜质量、芽干质量、根长、根粗、根鲜质量和根干质量，以各指标耐热系数为评价依据，采用相关性分析、主成分分析、隶属函数分析、逐步回归分析和聚类分析方法，对其萌发期耐热性进行鉴定及耐热相关指标筛选。

1.4 苗期和成株期耐热性田间鉴定

将38份快菜品(系)采用穴盘播种方式进行育苗，当幼苗长至3叶1心时，选取生长一致的健壮幼苗移栽到田间，田间管理均按常规。田间移栽后7 d(苗期)和25 d(成株期)，选取各品系15株进行热害症状调查，计算热害指数,鉴定其耐热性。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 萌发期指标测定方法 以胚根的长度超过种子半径视为发芽，分别在第3,5和7天调查发芽数，计算发芽指数，第14天统计发芽率。在第14天，从各重复中随机取出快菜芽苗5株，将芽苗与根系剪下分开，测定芽长、芽粗、芽鲜质量、芽干质量及根长、根粗、根鲜质量、根干质量。计算发芽率、发芽势、活力指数和发芽指数：

发芽率(GR)=第14天全部正常发芽种子数/供试种子数×100%。

发芽势(GE)=第7天正常发芽的种子数/供试种子数×100%。

发芽指数(GI)=∑(Gt/Dt)。

活力指数(VI)=发芽指数×幼苗生长势。

式中：Gt为在t日的发芽数，Dt为相应的发芽天数，幼苗生长势为胚根鲜质量(mg)。

1.5.2 苗期和成株期热害指数调查方法 参照张景云等[12]的方法，略有改动。热害分级标准为：0级(无热害症状，植株生长正常)；1级(植株受害叶片数<全株叶片数的1/3)；3级(全株叶片数的1/3≤植株受害叶片数<全株叶片数的1/2)；5级(全株叶片数的1/2≤植株受害叶片数<全株叶片数的2/3)；7级(植株受害叶片数≥全株叶片数的2/3)；9级(植株失去经济价值或死亡)。根据热害级数计算热害指数，热害指数越小，说明材料的耐热性越强。

热害指数=∑(X×Xi)/(A×N)。

式中：X为热害级数，Xi为X热害级数下的植株数，A为最高级数，N为调查总株数。

1.6 数据分析与评价

按照下式计算快菜萌发期各指标的耐热系数γ：

γ=处理组测定值/对照组测定值。

按照下式计算综合指标隶属函数值u(xi)：

u(xi)=(xi-xmin)/(xmax-xmin)，i=1,2,3,…，n。

式中：u(xi)为第i个综合指标的隶属函数值，xi为第i个综合指标值，xmin、xmax分别为该综合指标的最小值和最大值。

按照下式计算综合指标权重wi：

式中：wi为第i个综合指标在所有综合指标中的重要程度，pi为第i个综合指标的贡献率。

按照下式计算不同品系在高温胁迫下的综合耐热评价值D：

数据统计和分析使用Microsoft Excel 2003及SPSS 22.0软件进行。

2 结果与分析

2.1 快菜萌发期模拟高温胁迫最适温度的确定

对高温胁迫下6份快菜发芽各指标进行统计和方差分析发现，在不同温度下，6份快菜发芽均受到不同程度的影响(图1)。在25 ℃(对照)条件下，各参试品系的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数均最高，说明25 ℃是适宜快菜种子发芽的温度。35 ℃下，各品系的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数较对照25 ℃相比均下降，但在个别品系间差异不显著，不能有效区分各品系的耐热性差异，说明高温胁迫程度较轻；37 ℃高温抑制了快菜种子萌发，与对照相比，所有品系的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数均下降，耐热性强的品系与耐热性弱的品系间差异显著，说明这些指标在不同品系间分散程度较大，可较好地反映其萌发期的耐热性差异；42 ℃下，发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数与对照相比均降低，但快菜品系绝大多数种子不发芽，发芽率偏低，说明高温胁迫程度过重。所以，37 ℃可以作为快菜种子萌发期耐热性鉴定的适宜处理温度。

图柱上标不同小写字母表示同温度下各快菜品系间差异显著(P<0.05)Different lowercase letters indicate significant differences among lines at same temperature (P<0.05)图1 温度对各快菜品系萌发指标的影响Fig.1 Effects of different temperature treatments on germination index of seedling-edible Chinese cabbage lines

2.2 快菜各指标的耐热系数及其变异

由表2可知，高温胁迫后不同快菜品系的发芽率(GR)、发芽势(GE)、发芽指数(GI)、活力指数(VI)、芽长(BL)、芽粗(BD)、芽鲜质量(BFW)、芽干质量(BDW)、根长(RL)、根粗(RD)、根鲜质量(RFW)、根干质量(RDW)与对照相比均降低(耐热系数γ<1)。快菜品系上述指标在高温胁迫下的耐热系数介于0. 04～0. 97，说明各指标对高温胁迫反应的敏感性存在差异，采用单一指标不能准确鉴定供试种质的耐热性。不同品系上述指标耐热系数的变异系数介于0.05%～3.35%，说明所选快菜品系类型较丰富，代表性较好。综合而言，不同品系的单项指标表现不同，仅通过单项指标对其萌发期耐热性进行鉴定存在局限性。

表2 快菜各指标的耐热系数及其变异Table 2 Heat resistance coefficient and variation of indicators in different seedling-edible Chinese cabbage lines

2.3 快菜各指标耐热系数的相关性

由快菜各指标耐热系数的相关性矩阵(表3)可以看出，各指标(除芽粗)之间存在不同程度的相关性，且多数指标间相关性极显著。这说明各单项指标间存在信息重叠与交叉现象，影响了快菜耐热性的鉴定和筛选结果，需进行综合分析。

表3 38个快菜品系各指标耐热系数的相关性矩阵Table 3 Correlation matrix of heat resistance coefficient in 38 seedling-edible Chinese cabbage lines

2.4 不同快菜品系各指标间的主成分分析

对快菜38个品系各单项指标的耐热系数进行主成分分析(表4)发现，12个指标可转换为5个新的相互独立的综合指标，依次用CI1～CI5表示，其贡献率分别为66.93%，9.45%，7.09%，4.71%和4.46%，累计贡献率达92.64%，说明这5个综合指标包含了快菜萌发期耐热性的绝大部分信息。根据主成分分析原则，同一指标特征向量最大绝对值所在的主成分即为其所属主成分，通过分析各综合指标的特征向量可以看出，CI1中VI、RL、GE和GR指标的特征向量较大，CI2中BD的特征向量较大，CI3中BD、GI、GR的特征向量较大，CI4中RDW和RD的特征向量较大，CI5中RD的特征向量较大，说明这些指标的贡献率较大。

表4 38个快菜品系综合指标的特征向量及贡献率Table 4 Eigenvector and proportion of comprehensive indicators in 38 seedling-edible Chinese cabbage lines

2.5 不同快菜品系萌发期耐热性的综合评价

2.5.1 隶属函数分析 为进一步明确5个综合指标CI1～CI5对快菜萌发期高温胁迫耐受性的贡献，采用隶属函数法进行综合评价，获得38个快菜品系在5个综合指标中的隶属函数值，隶属函数值越大，说明该品系的耐热性越强。由表5可知，CI1中B33品系的隶属函数值最大为1，说明该品系CI1综合指标表现出的耐热性最强；B17品系的隶属函数值最小为0，说明其CI1综合指标表现出的耐热性最弱。CI2中B28品系的隶属函数值最大为1，说明该品系CI2综合指标表现出的耐热性最强；B5品系的隶属函数值最小为0，说明其CI2综合指标表现出的耐热性最弱。CI3中B12品系的隶属函数值最大为1，说明该品系CI3综合指标表现出的耐热性最强；B34品系的隶属函数值最小为0，说明其CI3综合指标表现出的耐热性最弱。CI4中B8品系的隶属函数值最大为1，说明该品系CI4综合指标表现出的耐热性最强；B23品系的隶属函数值最小为0，说明其CI4综合指标表现出的耐热性最弱。CI5中B26品系的隶属函数值最大为1，说明该品系CI5综合指标表现出的耐热性最强；B17品系的隶属函数值最小为0，说明其CI5综合指标表现出的耐热性最弱。

表5 不同快菜品系耐热性的综合评价Table 5 Comprehensive evaluation of heat tolerance in different seedling-edible Chinese cabbage lines

2.5.2 各综合指标权重和耐热性综合评价 由表5可知，5个综合指标的权重分别为0.722，0.102，0.077，0.051，0.048，进一步计算出不同快菜品系耐热性综合评价D值，并根据D值对耐热性强弱进行排序，其中B33品系的D值最大，表明其萌发期耐热能力最强；B17品系的D值最小，表明其萌发期耐热能力最弱。

2.5.3 逐步回归分析 为建立快菜萌发期耐热性数学评价模型，把D值作为因变量，各单项指标的耐热系数作为自变量进行逐步回归分析，得出预测不同快菜品系萌发期耐热能力的最优回归方程为：D=-0.022+0.609γVI+0.282γBL+0.302γRL(R2=0.962，F=963.315，P=0.000 1)。由方程可知，12个单项指标中活力指数、芽长和根长3个指标对快菜萌发期耐热性有显著影响。在实际应用中，可有选择性地测定这几个与D值密切相关的指标并求得耐热系数，进而利用该方程预测其他品系的耐热性。

2.5.4 萌发期耐热性聚类分析 由图2聚类分析结果可知，38个品系分为3大类：中等耐热型(Ⅰ)、耐热型(Ⅱ)和不耐热型(Ⅲ)。其中中等耐热型包括品系B26、B36、B28、B2、B19、B7、B34、B6、B32、B22、B37、B1、B27、B30、B4、B29、B21、B25、B8、B24；耐热型包括品系B10、B16、B23、B12、B18、B20、B38、B13、B3、B33，不耐热型包括品系B5、B15、B9、B35、B14、B11、B31、B17。

Ⅰ.中等耐热型；Ⅱ.耐热型；Ⅲ.不耐热型；图中各编号代表品系与表1相同，图3同Ⅰ.Medium heat resistance type;Ⅱ.Heat resistance type;Ⅲ.Heat-sensitive type；Numbers in the figure are same as those in Table 1.The same for Fig.3图2 38个快菜品系萌发期耐热性聚类分析结果Fig.2 Dendrogram result of clusters in 38 seedling-edible Chinese cabbage lines at germination stage

2.6 快菜苗期和成株期田间热害指数调查结果及耐热性聚类分析

为验证不同快菜品系耐热性评价结果的准确性，对不同快菜品系苗期和成株期田间热害指数进行调查，结果见表6。结合田间热害指数聚类分析结果，对参试的38份材料进行耐热性强弱划分。由表6和图3可知，苗期时，当热害指数在0.16～0.27时，参试材料为耐热型，划分为a类；当热害指数在0.33～0.49时，参试材料为中等耐热型，划分为b类；当热害指数在0.56～0.78时，参试材料为不耐热型，划分为c类。成株期时，当热害指数在0.20～0.33时，参试材料为耐热型，划分为A类；当热害指数在0.39～0.56时，参试材料为中等耐热型，划分为B类；当热害指数在0.63～0.93时，参试材料为不耐热型，划分为C类。综合图2、表6和图3结果来看，除B12品系外，其余37个快菜品系萌发期室内耐热性鉴定结果与苗期和成株期田间鉴定结果基本一致。

表6 不同快菜品系田间热害指数及耐热性分析Table 6 Analysis of heat injury index and heat resistance in different seedling-edible Chinese cabbage lines

3 讨 论

种子萌发期是植物生命史中最为重要的阶段，也是对外界高温胁迫响应较为敏感的时期。高温胁迫对种子萌发具有显著影响，研究结果表明，当温度高于快菜的适宜发芽温度时，其发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数均会随着温度的升高而降低，且耐热性越弱，其降低程度越明显。类似研究结果也出现在甜瓜[13]、萝卜[14]、油菜[15]、菠菜[16]、莴苣[17]等作物上，不同的是各物种抑制温度不一，如菠菜萌发期耐热性鉴定的适宜胁迫温度为30 ℃，莴苣则以35 ℃高温处理才能更好反映品种间耐热性差异。本研究发现,快菜萌发期模拟高温胁迫以37 ℃为宜，与上述几种作物均不同，可能与不同植物或同一植物的不同品种间对高温胁迫的耐受能力不同有关。

a、A.耐热型；b、B.中等耐热型；c、C.不耐热型a,A.Heat resistance type;b,B.Medium heat resistance type;c,C.Heat-sensitive type图3 38个快菜品系苗期和成株期的田间耐热性聚类分析结果Fig.3 Dendrogram result of clusters in 38 seedling-edible Chinese cabbage lines at seedling and adult stages

农作物抗逆性鉴定按照生育时期可分为萌发期鉴定、苗期鉴定和成株期鉴定[18-19]。相较而言，萌发期鉴定具有周期短、容量大、效率高、成本低、受环境因素影响小等优点，适用于资源和育种群体的大规模评价筛选，目前已被广泛应用于很多作物[20-24]。由于植物耐热性是一个受多基因控制的复杂性状，易受自身遗传背景及外界环境的影响，因此当采纳指标过少或不当时，耐热性鉴定结果往往具有片面性，难以准确、客观地反映作物的耐热本质[25-27]。同时，众多评价指标间又存在一定的相关性，导致它们所提供的高温胁迫响应信息发生交叉重叠，重要程度不尽相同[28]，本研究证明了这一观点，因此应采用多项指标综合评价快菜对高温胁迫的抗性。本研究通过计算快菜萌发期的12个关键指标的耐热系数来比较不同材料间的耐热能力，同时结合相关性分析、主成分分析、隶属函数分析、聚类分析及逐步回归分析，对快菜资源的耐热性进行综合评价，充分考虑了各指标在耐热性评价工作中的重要程度，又消除了材料间的固有差异及各指标计量单位不同带来的影响，使得评价结果较为客观、可靠。

本试验通过主成分分析将12项单项指标的耐热系数转换成5个新的相互独立的综合指标，根据各指标间权重得到耐热能力的综合评价值(D值)，通过D值聚类分析，筛选出10份耐热品系，20份中等耐热品系和8份不耐热品系。利用逐步回归法建立了快菜萌发期耐热性的评价回归模型：D=-0.022+0.609γVI+0.282γBL+0.302γRL，筛选出显著影响快菜耐热能力的3个单项指标:VI(活力指数)、BL(芽长)和RL(根长)。目前，关于快菜种子萌发期耐热性指标筛选尚无定论。但活力指数、芽长、根长与作物耐热性的关系在其他作物上已得到证明，如种子活力指数可作为唐山秋瓜[29]和紫花苜蓿[30]萌发期耐热性鉴定指标，芽长和根长可反映不同黄瓜品种间的耐热性差异[31-32]。本试验中38份快菜品系的耐热性由3个综合指标(VI、BL、RL) 共同决定，其萌发期耐热性室内鉴定结果与田间苗期和成株期鉴定结果基本相同，采用单一指标则无法鉴定某一材料的耐热能力。因此，在相同的逆境条件下，可通过测定这3个指标，利用此评价模型来预测目标材料的耐热性强弱。

综上所述，不同高温处理对快菜品系种子萌发的影响存在差异，萌发期37 ℃高温处理能够反映不同快菜品系之间的耐热性强弱。活力指数、芽长和根长可以作为快菜萌发期耐热性鉴定的首选指标，参试的38份快菜品系分成耐热型(10份)、中等耐热型(20份)和不耐热型(8份)3种，且萌发期鉴定结果与苗期和成株期田间鉴定结果基本一致。