外周血SEPTIN9基因甲基化检测在结直肠癌诊断中的研究进展*

宫媛 王卫华 杜海涛 吕昆明 常青 万军

结直肠癌（CRC）的发病率位居我国乃至全球各类恶性肿瘤第三位[1]，其发病率和病死率有逐年上升趋势，有效的早期筛查、诊断、复发监测及尽早干预治疗是CRC防治的关键。最近研究发现SEPTIN9基因与CRC发生密切相关，在癌组织中呈高度甲基化，是CRC发生发展过程中重要的分子特征。因此，检测患者血浆中SEPTIN9基因甲基化（mSEPT9）水平是CRC早期筛查和诊断的理想方式。

1 SEPTIN9基因甲基化（mSEPT9）与结直肠癌的发生关系

1.1 SEPTIN9基因概述：SEPTIN9基因编码的SEPTIN9蛋白在细胞代谢中发挥着重要的生理作用，能够调节细胞生长，防止细胞分裂过快或无控制的分裂增殖，具有相应的抑癌作用[2]。CRC的发生、发展与基因的甲基化密切相关[3,4]，其中SEPTIN9基因甲基化（mSEPT9）在CRC发生中的作用备受关注。异常高甲基化通常发生在基因启动子区CpG岛处[5，6]，mSEPT9会抑制SEPTIN9基因正常表达，使其抑癌功能丧失，并最终导致细胞分裂和癌变[4，7]。

1.2 mSEPT9检测试剂盒（Epi proColon）的应用：肿瘤细胞凋亡和坏死后，其DNA被释放入外周血，从而在外周血中可检测到异常甲基化的SEPTIN9基因DNA[8]。2008年，表观基因组学公司首次研究了外周血mSEPT9检测癌症的性能并随之推出第一代Epi proColon试剂盒（Epi proColon1.0），并于2012年在美国使用[5，9]。多个研究表明，Epi proColon 1.0在CRC筛查方面已经表现出很高的敏感性和特异性，其总体敏感性48%～73%，特异性82%～98%。第二代血浆mSEPT9检测试剂盒（Epi proColon 2.0）在DNA提取和PCR重复实验技术方面较第一代有所提高，检测敏感性稳定提升[10-12]。应用Epi proColon 2.0后，检测灵敏度从48.2%～73.3%[12-14]提高到约71.0%～95.6%[11，15-17]，特异性从80.0%～91.5%提高到84.8%～98.9%[18]。外周血mSEPT9是首个被美国FDA批准的用于CRC筛查的血液DNA甲基化标志物[10]。Epi proColon 2.0可以检测低至7.8 pg/mL的mSEPT9[19]。目前外周血mSEPT9检测筛查CRC的方法已在欧洲、美国大规模使用。2016年美国FDA批准外周血mSEPT9检测的方法（mSEPT9试验）用于50～75岁的平均风险人群的筛查[10]。在我国，国家食品药品监督管理总局（CFDA）已批准mSEPT9用于临床CRC的早期检测，并被国内指南所推荐[17]。

1.3 mSEPT9的计算方法与选择：mSEPT9试验的算法规定在m次PCR重复实验中至少需要出现n次阳性（n≤m），才可以判定试验阳性。常用的算法有1/1、1/2、1/3和2/3四种，1/1算法为1次PCR重复实验中要求出现1次阳性，则判断样品为阳性；1/2算法为2次PCR重复实验中要求至少出现1次阳性，则判断样品为阳性；依此类推。在不同的研究中，不同的算法其敏感性和特异性不同，有研究表明1/3算法的敏感性0.80，特异性0.85。2/3和1/1算法的敏感性和特异性非常相似（敏感性：0.74 vs 0. 73，特异性：0.95 vs 0.93）[20]。1/2算法敏感性最低0.59，特异性0.91。由此看出，1/3算法特异性较低但敏感性最好；2/3算法在敏感性和特异性之间提供了最佳的平衡，尽管其敏感性降低，但特异性最高，真阴性率高，整体性能最好，这与NIAN等[11]研究结论一致。因此，算法的选择应该基于研究的需求，如果是筛选试验，提高疾病的检测率，应该使用敏感度最高的算法，推荐1/3算法，如果是排除阴性患者，应该使用特异性较高的算法，推荐使用2/3算法。

2 mSEPT9在CRC的临床应用价值

2.1 mSEPT9检测CRC具有高敏感性和特异性：目前，国内外不同研究小组发表了一系列通过检测mSEPT9筛查早期CRC的临床研究，其敏感度（67.0%～79.3%）和特异度（86%～99%）[8，9，14，16，18，20]。多项meta分析[11，18，21-23]亦表明，mSEPT9检测CRC具有高敏感性和高特异性，NIAN[11]的针对25项研究的meta分析指出应用Epi proColon 1.0试验的总体敏感性为71%，总体特异性为92%，Epi proColon 2.0试验的总体敏感性为76%，总体特异性为94%。WANG[18]的meta分析后指出，应用Epi proColon 2.0检测mSEPT9的敏感度为71.0%～95.6%，特异性为84.8%～98.9%。LI[19]针对39个研究的meta分析表明mSEPT9的总体敏感性是62%，特异性是91%。SUN[20]的29项研究的meta分析指出mSEPT9的敏感性为69%（2/3算法）～74%（1/3算法），特异性为84%（1/3算法）～96%（2/3算法）。上述研究均为队列研究和病例对照研究。针对中国人mSEPT9试验机会性筛查（有症状高危人群）的RESEPT研究指出mSEPT9试验的敏感性为76.6%，特异性为95.9%[16]，且在Ⅰ期和Ⅱ期CRC患者敏感性64.9%和72.7%。SONG等[24]一项机会性筛选研究中，mSEPT9试验的敏感性为75.1%，特异性为95.1%。尤其是第二代检测试剂盒Epi proColon 2.0应用以来，其敏感性进一步提高至79.3%（2/3算法）～ 95.6%（1/3算法），特异性达到84.8%（1/3算法）～98.9% （2/3算法）[14]。而一项纳入来自美国和德国32个医疗机构的7 941例50岁及以上无症状人群的大样本CRC筛查研究（PRESEPT研究）[10]显示，mSEPT9试验检测CRC的总体敏感性为48.2%，总体特异性为91.5%。PRESEPT研究结果的敏感性明显低于上文中多项回顾性验证研究，其原因可归因于与该研究的筛查对象为无症状人群和1/2算法。无症状人群的敏感性肯定低于普通风险或高危风险的有症状人群的敏感性。如果1/2算法换为1/3算法，其敏感性为68.2%，特异性为80%[25]。由此可见，实验设计、人群的选择、试剂盒的选择和算法的选择都会影响结果的敏感性和特异性。外周血mSEPT9水平具有较高敏感性、特异性，且其依从性较高及侵入性较低，适合在易感人群中进行CRC筛查（表1）。

表1 mSEPT9的不同算法和试剂盒检测CRC的敏感性和特异性比较

表2 mSEPT9的不同算法和试剂盒检测不同分期CRC的敏感性比较

2.2 mSEPT9检测CRC的敏感性与其临床病理参数的关系：mSEPT9试验敏感性主要取决于外周血mSEPT9水平，而外周血mSEPT9主要来源于肿瘤细胞的释放。不同分期的肿瘤，其肿瘤大小，浸润程度，分化程度均各不相同，因此其外周血mSEPT9水平也有显著差异[26]。多项研究[8，11，12，15，24，27，28]表明，外周血mSEPT9阳性率与CRC临床分期有关，临床分期越晚，mSEPT9阳性率越高。组织分级越高，分化程度越低，mSEPT9阳性率越高[27]。且外周血mSEPT9水平与肿瘤最大直径呈线性关系[14，29，30]，而与肿瘤部位无关[27]。可见mSEPT9水平与CRC恶性程度呈正相关，可用来指导CRC临床分期（表2）。

2.3 mSEPT9具有评估CRC手术疗效和预测预后的价值：有研究[14，30]表明mSEPT9水平对CRC手术疗效有评价作用。外周血mSEPT9水平与CRC呈负相关性，术前mSEPT9阳性的CRC患者，术后mSEPT9水平降低，甚至转为阴性。术后高水平mSEPT9则预示CRC患者复发和死亡风险高，因此，术后mSEPT9状态能直接提示CRC患者是否存在隐匿性肿瘤细胞，监测mSEPT9水平可预测CRC手术预后和监测术后复发，可作为检测肿瘤进展和治疗效果的标记物[30-32]。

2.4 mSEPT9检测结直肠腺瘤和息肉的敏感性及影响因素：目前大部分研究发现，mSEPT9对腺瘤和息肉的阳性检出率低于15%[11，22，30]，这可能与从腺瘤发展为CRC的过程中，甲基化是慢慢扩展的，结直肠腺瘤中基因甲基化水平低于CRC有关。但也有研究证明，mSEPT9对重度不典型增生的息肉和直径＞1 cm腺瘤的检测价值远优于直径＜1 cm腺瘤和息肉[15，31]。SONG[24]等的临床研究同样证明mSEPT9对进展期腺瘤，尤其是含有绒毛成分和异型增生的腺瘤的检出率高。相较于上述研究[8，10，11，30]，该研究中mSEPT9高检出率或许与选用Epi proColon 2.0试剂盒，应用敏感性高的1/3算法，及区分不同性质腺瘤，尤其是针对含有绒毛和异型增生腺瘤的人群和高风险人群的原因有关。该研究证实了外周血mSEPT9水平的检测不仅可用于CRC的筛查，亦可作为CRC癌前病变的筛查（表3）。

表3 mSEPT9的不同算法和试剂盒检测结肠腺瘤或息肉的敏感性比较

2.5 联合mSEPT9和粪便免疫化学试验（FIT）检测CRC有助于提高敏感性：尽管mSEPT9对结直肠腺瘤检出率的效力存有争议，但mSEPT9的优势在于检测CRC的敏感性和特异性较高，单独应用mSEPT9的敏感性优于FIT和癌胚抗原CEA[77%vs（66.4%&41.3%）][20]。外周血mSEPT9试验和FIT均为无创试验，当前的研究多侧重于比较两者的诊断效力[16，32]。 然而这两种试验具有不同的原理和机制，mSEPT9和FIT筛查CRC有一定的互补性，联合检测mSEPT9和FIT有助于进一步提高敏感性[16，20，32]，其敏感性从单独应用mSEPT9的76%提高至94%。同时，联合检测对CRC的阴性预测值高达99.3%，阴性似然比仅为0.04，说明若两项试验均为阴性，则有助于排除CRC。

3 mSEPT9检测的影响因素 外周血mSEPT9的影响因素众多，年龄是影响mSEPT9筛查效果的因素之一，高龄可能降低其敏感性和特异性[10]，这可能是由于年龄的增长和全基因组DNA甲基化水平的提高，也可能是由于老年人慢性疾病的患病率较年轻受试者高，各种慢性疾病影响了DNA甲基化[33]，导致老年人血清标志物的水平受到其他因素的干扰风险增大，从而引起筛查敏感度的下降。我们还发现其他疾病如关节炎，动脉硬化和糖尿病对检测有影响[12]。同时，外周血mSEPT9在CRC患者中存在微弱的昼夜节律性[34]。最高mSEPT9浓度发生在午夜，平均（31.99±31.33）ng /mL；最低浓度时为下午6 时，平均（27.05±16.97）ng /mL；且mSEPT9浓度较低的情况下，日间活动可影响mSEPT9检测结果；因此样本采集的时间会影响检测结果，通过早晨收集样本可提高筛选灵敏度。然而TÓTH[34]研究的样本数量过少，这种节律性的存在与否需要更多的实验研究来证实。近期有研究证明种族与DNA甲基化状态之间有相应关系[35]。种族分层分析的研究显示，mSEPT9对亚洲人CRC的敏感性（0.75）好于对美洲人（0.71）和欧洲人（0.70）。然而，另一项研究显示了mSEPT9的低敏感性（0.363），不过该研究的差异可能来源于种族不同和试剂盒偏差[11，36，37]。

4 结语 综上所述，mSEPT9在CRC的筛查和早期诊断上具有较高敏感性和特异性，适合于易感人群的筛查；对CRC的分期、分级评价、治疗效果、复发监测和预后预测方面潜能巨大；但研究人群、实验设计、计算方法、试剂盒选择、年龄、其他疾病和种族差异均可影响mSEPT9检测结果；对无症状人群和腺瘤、息肉的筛查方面，mSEPT9的效力有待于进一步提高。在权衡敏感性和特异性基础上，mSEPT9联合其他标记物检测可提高诊断率，具有良好的应用前景。

利益冲突本文所有作者均声明不存在利益冲突。