软枣猕猴桃种质资源溃疡病抗性鉴定方法的建立与评价

温欣 秦红艳 艾军 王月 韩先焱 李昌禹

关键词软枣猕猴桃;抗性评价;细菌性溃疡病

猕猴桃溃疡病是由丁香假单胞菌猕猴桃致病变引起的严重的细菌性病害。因其蔓延速度快、发病范围广和致病性强等特点，成为危害猕猴桃植株生长、限制猕猴桃产业发展的主要病害。病原菌主要从气孔、皮孔及伤口等孔口侵入，危害树干、枝条、叶片及花，引起树体枝干溃烂，树势衰弱，叶片萎蔫和花器受损，严重的可致全园猕猴桃树体死亡。研究结果表明，猕猴桃不同种之问抗性不同，软枣猕猴桃Actinidia arguta、毛花猕猴桃A eriantha Benth.对溃疡病抗性明显强于中华猕猴桃A chinensisPlanch和美味猕猴桃A.chinensis var.deliciosa，但具体的评价结果受环境和评价手段的不同而有所差异。软枣猕猴桃是猕猴桃属的落叶藤本植物，对溃疡病抗性较强，至今未见果园大面积发病现象。但软枣猕猴桃不同种质资源问是否存在差异，以及种内不同种质资源的抗性变异状况等方面未见报道。本试验以51份软枣猕猴桃种质资源为材料，以中华猕猴桃中的高感品种‘红阳、美味猕猴桃中的中抗品种‘徐香为对照，采用离体半木质化枝条接种和功能叶片接种进行抗病性评价，研究不同软枣猕猴桃种质资源对溃疡病的抗性，明确不同种质问的抗性差异，筛选抗病性较强的软枣猕猴桃种质，为提高猕猴桃抗病性及抗病品种选育提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试植物

51份软枣猕猴桃资源均取自中国农业科学院特产研究所软枣猕猴桃资源圃。美味猕猴桃‘徐香和中华猕猴桃‘红阳为盆栽材料。选取健康、生长势中庸且均匀一致的半木质化枝条和功能叶片作为试验材料。

1.1.2供试菌种

丁香假单胞菌猕猴桃致病变种Pseudomonassyringae pv.actinidiae（Psa）菌株PSAM228为强致病力菌株，为西北农林科技大学果树病害病原生物学及综合防治研究团队实验室保存，由西北农林科技大学高小宁老师所赠。

1.2试验方法

1.2.1 PSAM228的GFPuv标记

参照黄其玲等的方法，略有改进。采用CaCle转化法对PSAM228菌株进行绿色荧光蛋白（GFP）标记，标记的PSAM228菌株（后文称GFPuv标记菌株）可在485nm紫外激发光下通过535nm滤光片观察到溃疡病菌在离体材料中的侵染状态。

1.2.2菌液最适培养时间筛选

用接种环蘸取PSAM228菌液在NA培养基上划线，然后置于（25±1）℃培养箱中暗培养2d。挑取单菌落于LB液体培养基中，25℃分别振荡培养12、18h和24h。在设定的培养时问吸取菌液，稀释后在NA培养基上涂板，置于（25±1）℃培养箱暗培养16h左右，用平板计数法计算菌液浓度。

1.2.3人工接种和抗性评价

取软枣猕猴桃不同种质资源健康、生长势中庸且均匀一致的半木质化枝条和功能叶片，先后用蒸馏水和无菌水洗净备用。参考黄其玲的接种方法并结合本试验加以改进。

1.2.3.1半木质化离体枝条接种

枝条采用刻伤接种方法。将枝条剪成约15cm长，用无菌解剖刀横切一个小口深至木质部，滴加20μL菌液后附湿润的无菌棉保湿。2018年采用没有GFPuv标记的PSAM228菌液;2019年采用GF-Puv标记的PSAM228菌液。

1.2.3.2离体叶片接种

2018年采用针刺叶片法接种。用无菌接种针在叶片上每隔1cm刺一个小孔（避开叶脉），布满整个叶片，并均匀地涂上没有GFPuv标记的PSAM228菌液，将叶柄处用湿润的无菌棉包好。

1.2.3.3离体叶脉接种

2019年采用叶脉注射法接种。即用无菌注射器从叶片基部的叶柄处注入GFPuv标记的PSAM228菌液20μL。

上述接种方法使用的菌液濃度均为10cfu/mL。每份资源分别接种5个枝条和5片叶片，重复3次，接菌后的枝条和叶片放人有湿润无菌滤纸的无菌培养皿中，在（18±1）℃的培养箱中培养，定期观察枝条韧皮部颜色变化和病斑长度、叶片病斑情况。接种后21d调查发病情况，刮除枝条感病部位的表皮，分别测量半木质化枝条病斑长度、叶片病斑面积和病菌沿主叶脉发展的长度。离体叶脉接种的叶片在485nm紫外光激发下，通过535nm滤光片可观察到GFPuv标记菌株发出的荧光，通过荧光可方便地测量病菌延展长度。离体枝条和叶片感病情况分为7级，如表1所示。

病情指数=∑（病枝数×病级值）/（调查总枝数×最高级值）×100。

参照石志军等的方法通过病情指数确定抗性。评价标准为：高抗，病情指数≤10;中抗，10<病情指数≤30;感病，30<病情指数≤50;中感，50<病情指数≤70;高感，病情指数>70。

1.2.4数据分析

应用Excel 2013、SAS 9.2软件进行数据分析。

2结果与分析

2.1菌液最适培养时间

利用平板计数法得到不同培养时间菌液的浓度，12h菌液浓度为10cfu/mL左右，18h菌液浓度为10cfu/mL左右，24h菌液浓度为10cfu/mL左右。接菌浓度以10cfu/mL为宜，因此18h为较佳培养时间。

2.2不同软枣猕猴桃种质资源抗性鉴定与评价

通过半木质化离体枝条和成熟叶片接种，可以看出不同抗性种质半木质化枝条发病后病斑大小有明显差异（图1），在软枣猕猴桃种质中‘桓优1号发病最严重，但病斑长度与中华猕猴桃‘红阳病斑长度差别较大;部分种质对溃疡病接近免疫，基本无发病现象，如雌性品种‘苹绿和雄性品种‘绿王‘61-1等。叶片针刺接种后21d在接种部位可观察到病斑，且不同抗性种质病斑面积有差异。叶脉接种后发现有些叶片表面无明显发病现象，但在波长485nm紫外光激发下，叶脉处可见明显的带有绿色荧光病菌侵染现象（图2），且不同抗性种质资源叶脉发病情况有明显差异，说明使用荧光标记的菌液接种使试验结果更加准确。但在紫外光激发下，接种GFPuv标记的PSAM228菌液的半木质化离体枝条未能清晰看见绿色荧光，因此仍以测量半木质化枝条发病的病斑长度为测量指标。