枸杞褐斑病菌stigmella lycii生物学特性研究

王艳 晋玲 申培增 吕娇娇

关键词枸杞褐斑病;枸杞小黑梨孢;生物学特性

枸杞属茄科Solanaceae落叶灌木，主要以果实人药，具滋肝补肾、益精明日之功效;根皮亦可入药，俗称地骨皮，具凉血除蒸、清肺降火之功效。枸杞主要分布于我国宁夏、甘肃、内蒙古、新疆等省区。甘肃省白银、酒泉、武威、金昌和张掖5市发展为枸杞主产区，年种植面积在3万～4万hm。但是随着栽培面积的不断扩大，枸杞病害发生日益严重，成为制约其产量和品质的一大因素。

枸杞褐斑病（病原为Stigmella lycii X.R.Chen&Yan Wang）是2010年課题组在甘肃省景泰县进行枸杞病害调查时发现的一种新病害，症状主要表现为在叶片、叶柄及花蕾上产生圆形、近圆形褐色至灰褐色病斑，严重时，病斑相互连接，引起大量落叶和落果。据调查，2010年该病害在白银市的景泰草窝、靖远五合、靖安等乡镇，发病率95%～98%，严重度2～4级，减产22%～25%，损失严重。该病最早于5月下旬开始发病，发病初期主要从叶缘开始形成褐色凹陷斑块，7月-9月降雨多，田间湿度大，病原菌再侵染频繁，病害蔓延迅速。病害持续时间长，可一直持续至枸杞果实采收期。其病原枸杞小黑梨孢S.lycii为目前小黑梨孢属Stigmella全世界报道的第3个种，在调查中发现，该菌在越冬前的落叶中和离体培养条件下均可形成子囊壳和子囊孢子，即该菌的有性态，课题组通过对该菌的系统发育地位分析表明，该菌为子囊菌门格孢腔菌目格孢腔菌科真菌。

目前国内外对于枸杞小黑梨孢的生物学特性、寄主范围以及引起的病害情况等均无相关研究报道。因此，本研究通过离体培养的方法测定了枸杞小黑梨孢在不同培养基、温度、pH、光照条件、相对湿度及不同营养条件下的生物学特性，为确定枸杞褐斑病在田间侵染和扩散的气象条件、病害的发生发展规律及制定综合防治措施提供一定的理论依据。

1材料与方法

1.1供试菌种

2016年自甘肃省景泰县草窝乡大田采集具有典型症状的枸杞褐斑病叶，经PDA分离培养，镜检确定为Stigmella lycii，纯化后接种使健康枸杞叶片发病的病菌，于4℃保存备用。

1.2生物学特性测定

1.2.1不同培养基对菌丝生长和产孢的影响

在生长20 d的菌落边缘打取菌饼（d=7mm）接种于以下11种供试培养基：1%枸杞叶（果）煎汁（取100g‘宁杞1号枸杞叶或果于1000mL水中煮沸10min，过滤，滤液加水补足1000mL，加入14g琼脂）、1%枸杞叶煎汁+PDA（马铃薯200g，葡萄糖10g，1%枸杞叶煎汁1000mL，琼脂14g）、1%枸杞果煎汁+PDA（马铃薯200g，葡萄糖10g，1%枸杞果煎汁1000mL，琼脂14g）、淀粉培养基（可溶性淀粉10g，水1000mL）、燕麦培养基（OA）、PDA、PSA、WA、Richard、Czapek培养基和玉米粉蔗糖培养基，每处理3皿，置于25℃±1℃光暗各12h交替条件下培养。菌丝生长量测定采用十字交叉法，每隔2d测定一次菌落直径（菌落直径=两次直径平均值一接种菌饼直径）。14d后计测产孢量，在菌落半径一半处打取菌饼（d=7mm）5块，置于盛有5mL蒸馏水的试管中，用玻棒捣碎，用血球计数板计测单位面积子囊孢子产孢量，重复5次，求平均值。

1.2.2温度对菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响

将菌饼接种于PDA平板上，分别置于5、10、15、20、25、30、35℃下培养，菌丝生长量及产孢量的测定方法同1.2.1。选用凹玻片悬滴法测定孢子萌发率，配制子囊孢子（培养菌菌龄30d）悬浮液和分生孢子（自然菌）悬浮液，将孢子悬浮液滴加在洁净的盖玻片中央，在其四周涂上少量凡士林，然后将其覆盖在凹玻片上，每隔1.5h测定一次孢子萌发率，直至10.5h孢子萌发率不再增长时，共测定6次。

1.2.3光照对菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响

将菌饼接种于PDA平板上，分别置于25℃连续光照、光暗12h交替及连续黑暗条件下培养，菌丝生长量及产孢量测定方法同1.2.1。采用凹玻片悬滴法测定孢子萌发率，分别置于20℃连续光照、光暗1.5h交替及连续黑暗条件下培养，每隔1.5h测定一次孢子萌发率。

1.2.4 pH对菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响

采用NaOH和HCl将PDA培养基的pH调整为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，将菌饼分别接种于上述PDA平板上，25℃下培养。用柠檬酸一磷酸二氢钾缓冲液配制pH为4.51、5.58、6.49、7.00、7.41、8.39、9.19的孢子悬浮液，20℃下凹玻片悬滴法培养。菌丝生长量及产孢量的测定方法同1.2.1。

1.2.5湿度对孢子萌发的影响

将孢子悬浮液均匀涂抹于载玻片上，在室温下自然干燥，用小容器调节法，以硫酸控制相对湿度，湿度设置为70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99.5%，以100%饱和湿度为对照，共9个处理，20℃下培养。菌丝生长量及产孢量的测定方法同1.2.1。

1.2.6营养对孢子萌发的影响

测定的营养物共计有6种：葡萄糖、枸杞叶片、枸杞果实、马粪、土壤（马粪和田问土壤收集于枸杞褐斑病菌标样采集地）和尿素。按照1g营养物加入5、10mL和20mL蒸馏水的比例依次配制1：5、1：10、1：20浓度的营养液。枸杞叶片（果实）榨出液：取1g叶片（果实）加入不同体积的蒸馏水，在预冷的研钵中研磨成不同浓度的枸杞叶片（果实）榨出液。马粪浸渍液和土壤浸渍液：将1g马粪（土壤）与不同体积的蒸馏水混合，300r/min充分振荡10min，后静置30min。取上清液配制孢子悬浮液，20℃下凹玻片悬滴法培养，其他同1.2.1。

2结果与分析

2.1病原菌的培养特性

表1结果表明：病菌在各种培养基上生长缓慢，适温下于最适培养基（1%枸杞叶煎汁+PDA）上，8d后菌落直径2.8cm;菌落生长以1%枸杞叶煎汁+PDA.玉米粉蔗糖培养基、1%枸杞果煎汁+PDA最好，14d菌落直径分别可达4.5、4.4、4.2cm，PDA、1%枸杞叶煎汁、OA、PSA次之，在Richard和WA上病菌不生长。病菌除在1%枸杞叶煎汁、1%枸杞叶煎汁+PDA、1%枸杞果煎汁+PDA.PDA和OA培养基上产生孢子外，在其他培养基上均未产孢，在1%枸杞叶煎汁上产孢量最大，为8.9×10个/cm。

在PDA培养基上，菌落生长速度为0.28 cm/d，菌落微隆起，淡黄褐色，边缘不整齐，气生菌丝白色，稀疏，后期密生大量黑色小颗粒，即病菌的子囊壳（图la）;在OA培养基上，生长速度为0.21 cm/d，菌落平铺，气生菌丝非常稀疏，后期产生大量子囊壳，埋生或半埋生于培养基中（图1b），PSA、1%枸杞果煎汁+PDA和1%枸杞叶煎汁+PDA培养性状同PDA;在1%枸杞叶煎汁培养基上，生长速度为0.20cm/d，气生菌丝稀疏，灰白色，绒状，层层叠起，子囊壳埋生或半埋生于培养基中（图1c）;在玉米粉蔗糖培养基上菌落生长速度为0.31cm/d，但是菌丝非常稀疏，仅在培养基表面扩展，在其余培养基上病菌仅在原菌饼上产生白色絮状菌丝。子囊孢子萌发时每个小细胞都能长出芽管（图1f）。

2.2病原菌的生物学特性

2.2.1温度对菌丝生长、产孢及孢子萌发的影响

该菌在10～30℃范围内均能生长，最适温度为25℃（表2）。病菌生长较缓慢，在25℃下，14d菌落直径4.5cm，而30℃时仅为0.13cm，表明高温能抑制该菌正常生长发育。在20～25℃下病菌可以产孢，适宜产孢温度为25℃，在此温度下产孢量高达0.9×10个/cm，与其他温度下的产孢量存在显著差异。子囊孢子和分生孢子分别在5～30℃和0～35℃可以萌发，20℃和25℃分别为其适宜萌发温度，萌发最高温度为30℃和35℃。该菌孢子萌发速度较快，最适温度下10h萌发率达90%以上。由此可见，该菌菌丝生长较缓慢，即病菌在叶片上扩展速度较慢，而孢子萌发速度较快，有利于初侵染和再侵染，且子囊孢子萌发适温较分生孢子的低5℃，适宜于越冬后初春引起初侵染。

2.2.2光照对菌落生长、产孢和孢子萌发的影响

表4结果表明，连续光照条件有利于菌丝生长和产孢，培养14d后，产孢量达5.7×10个/cm，与其他处理具有显著差异;表5结果表明，在光暗交替条件下，子囊孢子萌发率最高，连续光照条件下，分生孢子萌发率量高，10.5 h萌发率分别为93.5%和91.0%。连续光照有利于菌落生长、产孢和分生孢子萌发，但光暗交替有利于子囊孢子萌发。

2.2.3 pH对菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响

表6结果表明：病菌生长适宜的pH范围较寬，在pH 4.0～10.0范围内均能生长，pH6.5时生长最快，14 d菌落直径达4.8cm，菌落在碱性条件下生长较好，pH为9.0时菌落直径4.1cm，显著大于pH 5.0的3.5 cm;在pH为6.0～7.0时可以产孢，其余pH条件下均不产孢。

表7结果表明：子囊孢子在pH 4.5～9.2范围内均可萌发，pH7.0时萌发率最高，达93%，碱性条件下萌发率均达83%以上，酸性条件下萌发率除6.5以外均在80%以下。分生孢子在中性条件下萌发率较高，pH7.0萌发率为93.3%，菌丝的生长和子囊孢子萌发以偏碱性条件为好，而分生孢子萌发以中性偏酸条件为好。

2.2.4湿度对孢子萌发的影响

表8结果表明，子囊孢子在相对湿度95%～99.5%和水滴中均可萌发，以在对照水滴中萌发最好，达91.7%，与其他处理均有显著差异，相对湿度99.5%条件下的子囊孢子萌发率为15.7%，相对湿度90%以下子囊孢子不萌发。分生孢子在相对湿度75%～99.5%和水滴中均可萌发，以在对照水滴中萌发最好，达到97.3%，在99.5%的相对湿度下，萌发率43.3%，相对湿度70%时分生孢子不萌发，因此初春雨水较多的气候条件有利于病害完成初侵染。

2.2.5营养对孢子萌发的影响

结果表明（图2），尿素对子囊孢子萌发具有强烈的抑制作用。蒸馏水中，10.5h子囊孢子萌发率为93%，在供试的葡萄糖、叶片、果实、土壤不同浓度的营养成分对枸杞小黑梨孢孢子萌发具有一定的促进作用，子囊孢子萌发速率高于蒸馏水中，7.5h孢子萌发率即可达到90%。

枸杞小黑梨孢子囊孢子在不同的营养液中的萌发速率趋势较一致，从子囊孢子在蒸馏水、葡萄糖（1：10）、叶片榨出液（1：20）3种处理中的萌发速度来看（图3），在4.5～7.5h萌发最快，4.5h萌发率在30%左右，7.5h可达到80%以上，7.5～9h萌发变慢，9h以后萌发率不再增长。说明4.5～7.5h是子囊孢子萌发的最快时期，这与温度、湿度等试验中的结果一致。分生孢子的萌发速率与此相同。

3讨论

深入研究病原菌的生物学特性及发病流行条件，可为病害防治提供较完善科学的理论依据。本研究结果表明，枸杞褐斑病发生后，造成大量的落叶落果，病原菌在落叶中可形成子囊壳和子囊孢子越冬，子囊孢子的萌发最适温度比分生孢子萌发最适温度低5℃，适宜于早春越冬后的子囊孢子的萌发和侵染，造成病害始发。在25℃，田间有露水、雨后天晴或灌溉后田间湿度大的条件下，分生孢子4.5h萌发率在30%左右，7.5h可达到80%，因此，在枸杞生长期，田间病害扩展蔓延迅速。分生孢子萌发温度范围为5～37℃，最适温度为25℃，在35℃的高温下，10.5h后，分生孢子也有9.3%可以萌发，并且研究发现中性偏碱环境下适宜枸杞褐斑病菌生长，我国枸杞多种植在北方高温干旱地区，土壤多为盐碱地，因此田问病原菌再侵染频繁，病害持续时问长，蔓延扩展速度快。通过研究发现，枸杞小黑梨孢在甘肃省景泰县主要以菌丝体及子囊壳在地表和病残体上越冬，因此，在夏末冬初，清理田园，将病叶病果等病残组织集中烧毁或深埋，减少来年初侵染源，是防治该病发生和扩散的重要措施。在枸杞栽培管理过程中要注意种植地的灌溉和通风情况，通过降低环境中的温度和湿度来降低枸杞褐斑病的发病率，从而提高枸杞的产量和质量。总之，通过研究枸杞小黑梨孢的体外生物学特性，对该病害的后续研究以及田问防治提供了重要的参考。