滇朴丛芽病植原体的分子鉴定

陈健鑫 张宏雁 魏玉倩 洪英娣 马焕成 伍建榕

关键词滇朴丛芽病;植原体;扫描电镜（SEM）;PCR;系统发育树

滇朴，又名昆明朴、西藏朴、石朴，为榆科ulmaceae朴属celtis的一种高大乔木。该树种分布较广，在中国主要分布于云南、西藏、四川和广西一带。滇朴有一定的药用、观赏、经济、生态价值和一定的滞尘、释氧能力，在云南昆明作为常见的绿化行道树被大量人工栽植。滇朴上常发生由担子菌引起的半邊疯病、干基腐朽病和由子囊菌引起的白粉病。由植原体引起的丛芽病尚未见报道。

植原体（phytoplasma）是一类无细胞壁，专性寄生于植物韧皮部组织中，难以人工培养的原核生物。植原体主要由刺吸式口器的昆虫传播或由植物体无性繁殖材料传播，常引起植物矮化、黄化、丛枝和花变叶等症状，给农林业生产造成较大的损失。由于难以在人工培养基上生长，过去对于植原体的分类和命名与病毒类似，依据寄主植物名称和引起的典型症状命名，无法明确植原体的分类地位。随着现代分子生物学的普及，利用核糖体DNA序列对植原体进行鉴定和系统发育分析是常用且简便的方法。

本研究首次报道滇朴枝条发生丛芽症状，并对表现丛芽症状的组织进行扫描电镜观察及分子检测，证实滇朴丛芽病由植原体引起，并确定其分类地位。

1材料与方法

1.1材料

供试植物：滇朴Celtis kunmingensis健康植株枝条及丛芽病植株枝条采自澄江和昆明，所采样品均保存于西南林业大学森林灾害预警控制重点实验室-80℃超低温冰箱内。

主要试剂：2×CTAB、2%巯基乙醇、氯仿：异戊醇（24：1）、异丙醇、70%乙醇、1×TE、无菌双蒸水、植原体16S rDNA通用引物、2×PowerTaq PCRMasterMix、核酸染料（Gelview）、DNA ladder2000、琼脂糖、1×TAE，均购自昆明硕阳科技有限公司。

试验对照：以本实验室保存的干热河谷车桑子丛枝病植株总DNA为本试验的阳性对照，滇朴健康植株总DNA及无菌双蒸水为阴性对照。

1.2韧皮部组织扫描电镜观察

将表现丛芽症幼嫩枝条组织和健康组织分别切为1mm厚的平整组织块，用导电胶带粘贴在载物台上喷金处理1min，置于日立S-3000N扫描电镜下观察。

1.3滇朴枝条总DNA提取

采用略改动的CTAB法提取植物总DNA。方法如下：用无菌刀片分别切取表现丛芽症状的幼嫩枝条及健康的幼嫩枝条，经液氮速冻后研磨至粉末状，用天平分别称取0.1g迅速转移至1.5mL离心管内;加入600μL 65℃预热的2×CTAB抽提液及2%巯基乙醇，涡旋混匀1min后置于65℃恒温水浴锅内温浴1h，期问每隔10min颠倒摇匀1次;取出后冷却至室温，加入600μL氯仿：异戊醇（24：1），颠倒混匀2～3min，10000r/min离心15min弃下层废液后重复该步骤1次;将上清液转移至新的离心管中并加入2/3体积预冷的异丙醇，颠倒混匀后置于-20℃冰箱30min，10000r/min离心15min后丢弃液体;加入800μL 70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，置于超净工作台彻底风干;加入50μL 1×TE缓冲液溶解DNA沉淀，置于-20℃冰箱保存备用。

1.4植原体16S rDNA基因PCR扩增

依据Schneider等和Lee等设计的植原体16S rDNA通用引物P1/P7、R16F2/R16R2（表1），采用巢式PCR扩增植原体16S rDNA基因。操作如下：将植物总DNA作为模板用于第一轮PCR，反应采用30μL体系，含有2XPower Taq 15μL，上下游引物各0.75μL，模板DNA 1μL，ddH20 12.5μL。反应条件为：94℃预变性5min;94℃变性30s，48℃退火40s，72℃延伸2 min，35个循环;72℃延伸10 min。将第一轮PCR产物稀释20倍作为第二轮PCR的模板，反应体系同第一轮PCR，反应条件为：95℃预变性5min;95℃变性30 s，60℃退火1min，72℃延伸90s，35个循环;72℃延伸10min。取4μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5巢式PCR产物序列测定及分析

通过1%琼脂糖凝胶电泳检测后，将明亮单一条带的巢式PCR产物送昆明硕擎生物科技有限公司测序。双向测通后的序列用DNAMAN 8拼接。依据Lee等修订的植原体分类体系，将滇朴丛芽病植原体序列与16SrⅠ～Ⅸ9个组中的代表序列（表2），进行同源性分析并与NCBI核酸数据库中同源性最高的序列进行双序列碱基比较。

1.6系统发育树的构建

将拼接结果提交至National Center for Bio-technology Information（NCBI）核酸数据库获得登录号并进行BLAST比对。选取植原体16Sr组及亚组的代表菌株，并以Acholeplasma laidlawii为外群（表3），利用Clustalx 1.83进行多重对比，通过MEGA 6中邻接法（neighbo-joining，NJ）以1000进行bootstrap校验，构建基于16S rDNA的系统发育树，确定菌株的亲缘关系。

2结果与分析

2.1染病滇朴症状表现

染病滇朴的症状见图1。滇朴幼树易染病，发病严重的植株主干及侧枝上遍布几十个成团簇生的不定芽，簇生的不定芽往往不能顺利萌发，易受冻害或日灼影响而枯死。簇生的不定芽在枝条上呈肿瘤状，极少数萌发后长出小叶，生长势弱的小叶易受病原真菌侵染后变黑枯萎。染病植株较健康植株叶发黄变小，生长缓慢，生长量受到抑制。在滇朴幼嫩的枝条和叶片上可见大量木虱，集中在叶片的背面刺吸，叶面出现点状的褪绿斑且留下了大量的蜜状分泌物。

2.2韧皮部切片扫描电镜观察

染病组织扫描电镜结果见图2。滇朴丛芽部位平整横切放大1800倍后在韧皮部的筛管组织中可观察到植原体，菌体较小，椭圆形;健康植株韧皮部组织内无植原体存在。

2.3PCR扩增结果

以滇朴丛芽病植株总DNA为模板进行巢式PCR扩增，结果见图3。第一轮PCR扩增获得了约1.8kb的条带，第二轮PCR获得约1.2kb的条带，该片段大小与阳性对照片段和预期片段大小基本一致，以健康组织总DNA及ddH20为模板的阴性对照未扩增出特异性条带。结果表明：表现丛芽症状的滇朴存在植原体，暂将其定名为滇朴丛芽植原体（Celtis kunmingensis plexus bud phytoplasma，CKPD）。

2.4滇朴丛芽病植原体16SrDNA序列分析

通过同源性分析，结果表明2个地区的显症滇朴巢式PCR产物序列相似性为100%，因此选择昆明地区滇朴丛芽病植原体的扩增序列进行后续分析。巢式PCR扩增获得1条1179bp的植原体16SrDNA序列（GenBank登录号：MTl60417），其中G+C占比47.24%，该百分比处于植原体16S rDNA序列G+C比例的范围内（47%～48%）。将滇朴丛芽病植原体16SrDNA序列与16Sr组中已知分类地位的9个代表菌株的序列进行同源性分析，结果表明滇朴丛芽病植原体与Aster yellows phytoplas-ma，AY相似性最高，达到99.20%，初步判定其属于16Sr工组中的成员;通过与NCBI数据库中同源性最高的芝麻变叶植原体Sesame phyllody phyto-plasma，SeP（KF728953）进行双序列碱基比对，发现二者相似性高达99.40%，两者16S rDNA碱基序列存在11个位点的差异，分别位于滇朴丛芽病植原体碱基序列的第2、3、17、18、216、849、865、869、870、874、1163位。

2.5系统发育树构建

通过MEGA 6中邻接法构建系统发育树（图4），结果表明CKPD与Maize bushy stunt phyto-plasma，MaBS（AY265208）、Aster yellows phyto-plasma，AY（L33767）及SeP（KF728953）处于同一进化支，共同聚为16SrⅠ组，且系统发育树中所有植原体株系均与外群菌株A.laidlawii有较远的亲缘关系，再选取16SrⅠ组中各亚组的代表菌株构建系统发育树（图5），结果表明CKPD与Dogfennelyellows phytoplasma，DfY和SeP处于同一进化支，即CKPD与16SrⅠ-B亚组中的株系亲缘关系较近，可推测CKPD为16SrⅠ-B亚组成员。

3讨论

滇朴丛芽病在澄江和昆明等地大量发现，且呈现逐渐加重的趋势，对显症的滇朴进行大量调查发现，其丛芽病状明显但无明显病征，因此推测该病由植原体引起且尚未见有关文献报道。本文通过扫描电镜和16S rDNA序列分析，证明了滇朴丛芽病是由植原体引起，滇朴丛芽病植原体CKPD与芝麻变叶植原体SeP（KF728953）相似性高达99.40%，同时选取植原体16Sr组及亚组的代表菌株构建系统发育树，确定滇朴丛芽病植原体为16SrⅠ-B亚组成员，滇朴丛芽病属国内首次报道滇朴的一种植原体病害，为进一步研究云南省植原体病害的种类提供了理论依据。

随着分子生物学技术及计算机技术的广泛运用，通过restriction fragment length polymorphism（RFLP）虚拟分析可获得限制性酶切图谱，不断补充和完善植原体的遗传信息，推动了植原体的系统发育学研究。据统计，植原体共有33个组，超过110个亚组和35个候选种。核糖体蛋白（riboso-mal protein）rp基因较16S rDNA基因有较大的变异，是进一步划分植原体类群的一个分子标记。Martini等根据rp基因建立了19个植原体亚进化支。延伸因子（elongation factor Tu，tuf）是植原体适应和进化的一个重要基因，其变异性更大，保守性更低，能够体现不同植原体株系之问变异性和多样性。sec转运酶是被广泛关注的原核生物蛋白转运系统之一，分泌蛋白基因（secretary protein，secY）比16S rDNA基因具有更大的变异程度，在植原体同组及同亚组内株系的精确划分中更具有效性，secY基因的深入研究有助于了解植原体的致病机理及制定病害的有效预防措施。本研究只鉴定了澄江和昆明的滇朴丛芽病样品，利用1179 bp的巢式PCR产物片段构建亚组系统发育树时自展支持率不高，在后续研究中可将巢式PCR产物纯化后与载体连接导人感受态细胞，筛选阳性克隆子，测序获得大于1200bp的片段，通过RFLP分析结果与系统发育树相互印证，验证CKPD准确的亚组地位。

云南地形复杂、气候条件良好，有较高的生物多样性，为植原体及媒介昆虫的适应及进化提供了有利的外界环境条件，同时，云南也成为植原体病害多发的地区。在云南已报道了多种由16SrⅠ组成员引起的植原体病害，其中16SrⅠ-B亚组成员在云南分布较广，可以侵染多种植物，使寄主植物表现丛枝、扁茎及黄化等不同类型的症状。在自然条件下，寄主植物、植原体及媒介昆虫构成一个互作体系，植原体借助刺吸式口器昆虫进行传播。在采集显症枝条时，发现植物幼嫩的枝条和叶片有大量的木虱为害，木虱若虫集中在叶背刺吸植物汁液，想要证明木虱是否为滇朴丛芽病植原体的媒介昆虫，需对为害滇朴的木虱进行调查与收集，提取木虱总DNA，参照Folmer等设计的引物LC01490/HC02198扩增线粒体COI（細胞色素氧化酶I）基因加以验证。

目前，针对植原体病害还缺少成熟有效的防治技术，通过破坏病害三角与侵染循环，做到病虫兼治，可有效防控植原体病害。首先，了解媒介昆虫的生活史做到适时防治，选择低毒缓效的杀虫剂控制刺吸式口器昆虫的数量;其次，利用四环素类抗生素对幼树注射或浇灌，修剪时及时处理伤口;最后，加强人工管控，适地适树，增强树势。今后，植物有益内生菌的应用、植物化感作用、脱毒苗的培育及导人抗性基因培育转基因植株在植原体病害防控上有较大的潜力及应用前景。