首个人猴嵌合胚胎在争议中诞生

南方周末特约撰稿　汤波

人猴嵌合胚胎。

★一个国际小组首次在实验室成功培育出“半人半猴”嵌合胚胎，尽管胚胎发育到二十天就被终止，但这项研究打开了人与非人类嵌合体的潘多拉盒子，开发人-非人嵌合体也许只是时间问题。

将人类干细胞放入猴子的胚胎会发生什么？　近日，中国、美国和西班牙的一个国际联合研究小组进行了这种尝试，将人类诱导多能干细胞植入食蟹猴胚胎中，首次在实验室成功培育出“半人半猴”嵌合胚胎，证明人类干细胞可在食蟹猴胚胎中分化。研究人员希望这项研究将来用于人类胚胎发育和异种器官移植等研究。2021年4月15日，该研究成果发表在国际著名学术期刊《细胞》上，引发广泛关注。

人猪嵌合胚胎在先

来自昆明理工大学、美国索尔克（Salk）生物研究所、美国得克萨斯大学西南医学中心和西班牙加泰罗尼亚大学圣安东尼奥·穆尔西亚分校的研究人员，参与了此项研究。

美国索尔克生物研究所胡安·卡洛斯·伊斯皮苏阿·贝尔蒙特（Juan Carlos Izpisua Belmon-te）博士领导了此项国际合作研究。早在2017年，胡安·卡洛斯团队首次尝试将大鼠诱导多能干细胞植入小鼠早期胚胎中，培育出大鼠与小鼠嵌合胚胎。在此之前，小鼠胚胎已通过基因编辑敲除了控制胰脏等器官发育的关键基因，如果没有其他处理，这些小鼠胚胎相关器官一般不能正常发育，甚至很难存活。不过研究人员发现，当小鼠胚胎植入大鼠干细胞之后，这种大鼠-小鼠嵌合胚胎不仅能在小鼠子宫中正常发育，小鼠原本不能发育的胰脏等器官竟然能正常发育。原来这些大鼠干细胞填补了小鼠胰脏细胞的“空位”，帮助小鼠发育出含有大鼠细胞的嵌合胰脏，其大小也与大鼠胰脏差不多。

更引发关注的是，胡安·卡洛斯团队将人诱导多能干细胞植入了猪的早期胚胎，首次培育出人猪嵌合胚胎，这些嵌合胚胎植入代孕母猪子宫后又发育了3到4周时间。与普通胚胎相比，这些嵌合胚胎在母猪体内的发育情况没有显著差异。不过，人类细胞在猪胚胎中的嵌合率非常之低，每个嵌合胚胎中能检测到的人类细胞平均不到10个，每10万个猪细胞中大约只有一个人类细胞。这种细胞比例很难用于后续的基础研究，更谈不上异种组织和器官开发了。

进一步分析发现，人类细胞难以嵌入猪胚胎中的主要原因是两个物种间的进化距离较远，一般认为物种间进化距离越近，其嵌合胚胎越容易形成。人与啮齿类动物以及人与有蹄类动物的进化距离均超过了9000万年，而人与猴子进化距离大概在3000万-4000万年之间。值得一提的是，大鼠和小鼠的进化距离只有2100万年，之前大鼠和小鼠间的嵌合体已证明异种组织和器官移植的应用潜能。因此，胡安·卡洛斯博士等人认为采用灵长类动物胚胎可能更容易获得物种间嵌合胚胎，从而开展后续研究。

人猴嵌合胚胎更有前途

不过，国际上开展灵长类动物分子生物学研究并不多，一方面成本较高，另一方面容易受到各种限制。因此，胡安·卡洛斯博士开始寻找合作者，正好发表在《细胞》杂志上的人猪嵌合胚胎研究论文的第一作者吴军博士来自中国。

昆明理工大学的季维智院士、谭韬教授和牛昱宇教授等人在灵长类动物胚胎体外培养、基因编辑和干细胞等领域取得了一系列国际领先的研究成果。不过，由于成本和动物福利等问题，人猪嵌合胚胎的体内发育方式并不适合在猴子身上推广。2019年11月，季维智院士、谭韬教授与胡安·卡洛斯团队合作，通过改进人体外胚胎培养方案，开发出一种猴子胚胎体外培养系统，使得胚胎可在体外发育到20天，体外胚胎呈现出了与体内发育胚胎高度一致的形态学与基因表达特征，包括灵长类动物胚胎早期发育的主要事件，为后续人猴嵌合胚胎研究奠定了重要基础。该研究成果发表在《科学》杂志上，牛昱宇教授为共同第一作者之一，吴军为作者之一，而季维智院士、谭韬教授与胡安·卡洛斯博士则为共同通讯作者。

在刚刚发表的人猴胚胎研究论文中，这五位科学家并列为共同通讯作者。

在人猴嵌合胚胎研究中，研究人员采取了人猪嵌合胚胎类似的技术路线，不过进行了一些重要改进。除了采用2019年建立的猴子胚胎体外培养系统之外，研究人员还通过加入促进干细胞分化的化合物组合，对人诱导多能干细胞进行了改进，使其具有更高的嵌合能力。

研究人员首先通过人工授精等技术在体外培养食蟹猴胚胎至囊胚阶段，然后通过显微注射方法，将筛选获得具有较高嵌合能力的人多能干细胞注入食蟹猴囊胚中，随后在所有第七天的食蟹猴囊胚中，都能观察到提前标记过的人多能干细胞，证明该人多能干细胞系在食蟹猴胚胎中也具有较强的嵌合能力。

接下来，人猴嵌合囊胚开始附着于培养皿上进一步发育，附着率与普通食蟹猴囊胚没有显著差异。随着时间的推移，能观察到人多能干细胞的人猴嵌合胚胎占比逐渐减少。在受精后第9天，约有一半胚胎含有人多能干细胞，到13天，人猴嵌合胚胎只占三分之一。注射人多能干细胞的猴子胚胎发育比率略低于非注射胚胎的发育比率，到受精后第15天，发育比率更是急剧下降。

有意思的是，从受精后第13天开始，人猴嵌合胚胎中人类细胞倾向于聚集在一起，并与猴胚胎的上胚层逐渐分离。人多能干细胞更倾向于分化成上胚层细胞和下胚层细胞，滋养层细胞则非常少。在上胚层中，人类细胞占比最高是到受精后第15天的7%，而下胚层到受精后第19天，人类细胞最高可占到的5%，而从受精后第11天开始，滋养层中基本检测不到人类细胞，不过人类细胞在人猴嵌合胚胎的发育程度和比例要比人猪嵌合胚胎高得多。

基因表达分析表明，人猴嵌合胚胎中的猴干细胞基本按照原有路径进行分化，形成不同类型的特定细胞，而其中的人类细胞虽然也能分化成几种主要种系细胞类型，不过这些细胞更倾向于“抱团”，而且人类干细胞在嵌合胚胎中的发育进程显著慢于正常发育的人和食蟹猴胚胎。另外，人猴嵌合胚胎中的猴干细胞和人干细胞的基因表达也是相互影响的，如相对于人类胚胎，嵌合胚胎中人上胚层样细胞的基因转录表达图谱更接近嵌合胚胎中的猴上胚层细胞，反之亦然。

仍然面临伦理争议

研究人员在实验设计、实际操作等环节均充分考虑了伦理因素，比如遵照相关国家的规定、进行广泛的伦理咨询和审查以及将嵌合胚胎限定在早期20天之内。不过，由于人类和食蟹猴同属于灵长类动物，进化距离较近，因此人猴嵌合胚胎研究仍然在国际上面临一定的伦理争议。

胡安·卡洛斯教授对媒体表示，他的团队无意尝试用这种“半人半猴”的嵌合胚胎来创造动物，不过仍然有人认为，嵌合胚胎离嵌合体只有一步之遥。牛津大学惠康伦理与人文中心联合主任朱利安·萨弗勒斯库（Julian Savulescu）教授对媒体表示，尽管人猴嵌合胚胎发育到20天就终止了，但是这项研究打开了人与非人类嵌合体的潘多拉盒子，成功开发人-非人嵌合体也许只是时间问题。

人猴嵌合胚胎能不能进一步发育成人猴嵌合体呢？　技术上应该没有问题。据2019年12月《蛋白与细胞》杂志的报道，中国科学院动物研究所干细胞与生殖生物学国家重点实验室的研究人员将食蟹猴的诱导多能干细胞移植到猪早期胚胎中，获得猴猪嵌合胚胎。他们还将四千多枚嵌合胚胎移植到母猪子宫内，最后产下10只猪崽。科学家通过绿色荧光蛋白进行追踪，其中有两只是猪猴嵌合体，它们的大部分器官如心脏、肝脏等都含有猕猴的细胞，比例在千分之一到万分之一之间，不过这些猪都在一周内死亡。这是首次培育出猴猪嵌合体，证明嵌合胚胎有可能发育成嵌合体。

《细胞》杂志在同一期还刊发了斯坦福大学亨利·格里利（Henry Greely）教授和杜克大学妮塔·法拉哈尼（Nita Farahany）教授的评论文章。两位生物伦理学家在文章中指出，不能排除有人培育人猴嵌合体的可能，呼吁研讨如何设定科学家在这一领域的研究边界。

《自然》杂志在报道这一新闻时指出，预计下个月，国际干细胞研究学会将出台修订后的干细胞研究指南，将明确禁止培育人-非人灵长类动物嵌合体，并监督人与非人灵长类动物嵌合胚胎中枢神经系统发育方面的研究。从2015年开始，美国国立卫生研究院（NIH）宣布暂停人与动物嵌合研究进行联邦经费资助，目前正在等待国际干细胞研究学会相关指南出台，以决定是否修改经费禁令。

尽管面临伦理争议，不过研究人员认为，人猴嵌合胚胎模型的效率要显著优于人鼠嵌合胚胎和人猪嵌合胚胎。在严格遵守伦理规范的基础上，人猴嵌合胚胎有望在再生医学、异种移植组织和器官等方面发挥积极作用。