濒危植物大花黄牡丹种胚快速成苗技术研究

尹 秀，张二豪，李 芳，杨 雪，蔡 皓，禄亚洲1，

（1.西藏农牧学院高原生态研究所，林芝860000；2.西藏农牧学院⁃西南大学药用植物联合研发中心，林芝860000；3.西藏农牧学院食品科学学院，林芝860000）

毛茛科芍药属大花黄牡丹（Paeonia ludlowii（Stern et Taylor）Hong）为西藏特有濒危植物，其黄色花大且色艳［1］，具有重要的观赏价值和药用价值，其根部含有丹皮酚，为常用藏药。大花黄牡丹生存条件极为苛刻［1⁃2］，为丛生灌木［3］，属国家二级濒危植物，喜温和气候，较耐寒，抗旱能力较弱［4］。目前，有关大花黄牡丹的研究主要集中在分类学［5］、生态学［6］、栽培学［4］、孢粉学［7］、病理学［8］、生理学［9］和形态学［10］等方面，而有关植物组织快繁方面的研究尚鲜见报道。

大花黄牡丹种子繁殖时，播种当年上胚轴休眠，只生根不发芽，第二年才发芽，育苗时间长，从而限制了种群的更新和发展［11］。虽然能通过物理和化学药剂处理［12⁃17］提高萌发率及缩短萌发时间，但效果有限，育苗周期仍较长，且受季节限制。本研究探索将植物组织培养技术运用于大花黄牡丹的繁育，以提高成苗率及缩短育苗周期，大量繁育幼苗，提高大花黄牡丹幼苗的种群数量。

1 材料与方法

1.1 材料

2018年9月底于西藏自治区林芝市南伊沟采集大花黄牡丹果荚，采集后置于阴凉通风处，外种皮发黑时转至室外暴晒，备用。

1.2 方法

1.2.1 种子消毒

将种子转至超净工作台，倒入无菌瓶中，加入75%乙醇，消毒30 s，无菌水冲洗1 次，0.1%升汞消毒12～15 min，无菌水冲洗3～5次，室温浸泡2 d，备用。

1.2.2 不同的接种方法

方法1：对照组，不进行任何处理，直接接种；方法2：去种皮，即剥去种皮后接种至培养基上；方法3：纵切种子，暴露出胚且保持胚的完整性，接种时切面不接触到培养基；方法4：横切种子，将带有胚和部分胚乳接种于培养基；方法5：剥去种皮及胚乳，分离出种胚，接种至培养基表面。种子经过以上5 种方法处理后，分别接种至以下10 种不同的芽诱导培养基上，基本培养基为MS+3%蔗糖+0.7%琼脂粉，pH 6.0。每瓶接种5粒，每种方法各接种5瓶。

接种后转至培养箱中进行培养，温度为18 ℃～20 ℃、光照强度为1 000～2 000 lx、14 h光照/10 h黑暗。

1.2.3 生根培养

将培育出的无菌苗转接到7 种生根培养基中，基本培养基为1/2MS+3%蔗糖+0.7%琼脂粉，pH 6.0。培养条件为18 ℃～20 ℃、1 000 lx、14 h光照/10 h黑暗。

1.3 数据统计

接种3 d后，统计萌发率，萌发率（%）=胚萌发数量/接种数量×100%。待长出真叶时，统计成苗率，成苗率（%）=幼苗数量/接种数量×100%。待幼苗长出明显的根时，统计生根率，生根率（%）=生根幼苗数量/接种数量×100%。

2 结果与分析

2.1 不同外植体处理方式对幼苗诱导的影响

将经过5 种方法处理的大花黄牡丹外植体接种到不添加植物生长调节剂的MS培养基上，通过各实验组的萌发率和成苗率对比，剥离种胚，直接将种胚接种到MS 培养基上，萌发率和成苗率均达到最大值，分别为59.60%和51.75%，表明此处理方法为外植体的最优处理方法（表1）。方法5 培养6～9 d，种胚开始萌动，10 d种胚萌发，18 d子叶抽出，长约1～2 cm。

表1 不同处理方式对幼苗诱导的影响Table 1 The effect of different treatment methods on seedling induction

2.2 不同植物生长调节剂配比对幼苗的诱导效果

种胚培养的最优激素配比为：MS+0.5 mg/L 6⁃BA+0.5 mg/L IAA+0.2 mg/L GA3，萌发率和成苗率达到最大值，分别为72.25%和70%（表2）。将胚接种到上述培养基上培养（图1），3～5 d 种胚开始萌动（图2），7 d 种胚萌发，15 d 子叶抽出（图3），长约1～4 cm，30 d胚根抽出，然后将大花黄牡丹的无菌苗转接到生根培养基上1/2 MS+1 mg/L IBA+0.2 mg/L NAA 培养生根（图4），生根率高达93%（表3）。

2.3 无菌苗的炼苗移栽

待无菌苗苗龄达到2～3 个月，幼苗高约5 cm（图5），打开培养瓶的瓶盖，炼苗1～2 周，移栽到透气性好经灭菌的腐殖土中（图6），15 ℃～18 ℃，避光、湿度为45%～60%的环境中培养，2 周后，逐渐降低湿度，待长出新根或新叶后转至强光下培养。

3 讨论与结论

牡丹组植物种子均具有休眠萌发特性，包括上胚轴及下胚轴休眠，且上胚轴休眠更为突出［18⁃20］。早在13 世纪初，便提出种子推迟发芽与抑制物质有关［20⁃24］。一些产生于植物种子内部或外部的有机酸、酯类、醛类、生物碱和脱落酸等物质通过抑制种子的酶活性、抑制呼吸、阻碍胚生长等，间接抑制种子的萌发［25⁃30］。本实验发现剥去种皮和胚乳，分离种胚，直接将种胚接种到MS培养基上，萌发率和成苗率菌达到最大值，分别为59.6%和51.75%，培养6～9 d，种胚开始萌动，10 d 种胚萌发，18 d 子叶抽出，长1～2 cm，2～3 个月成苗。

表2 不同浓度培养基对胚芽诱导的影响Table 2 Effects of different concentration mediums on embryo induction

表3 不同浓度培养基对胚根诱导的影响Table 3 Effects of different concentration mediums on radicle induction

传统播种育苗周期为2 年，大花黄牡丹种子繁殖时，播种当年上胚轴休眠，只生根不发芽，第二年才发芽，育苗时间长。综上所述，表明大花黄牡丹种皮和胚乳中可能存在抑制种胚萌发或诱导种胚休眠的物质，有待进一步深入研究。

本研究中，大花黄牡丹种子的成苗率能够达到70%，相比大花黄牡丹自然状态下种子繁殖时种子发芽率和成苗率（低于5%）［3］提高了60%～65%。人工播种，大花黄牡丹的种子成苗周期为两年（第一年胚根萌发，第二年子叶萌发），通过此方法种子的成苗周期为3个月，大大缩短了大花黄牡丹种子育苗的周期。

图1 种胚的萌动Figure 1 Germination of an embryo

图2 胚芽的萌发Figure 2 Germination of germ

图4 诱导生根Figure 4 Induced rooting

图5 获得无菌苗Figure 5 Obtaining sterile seedlin g

图6 无菌苗的移栽Figure 6 Transplanting of sterile seedling