发酵肉制品中微生物对生物胺形成机理的影响研究

王丹，孙学颖，刘建林，赵丽华，靳烨

（内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特 010020）

发酵食品有着古老的历史，距今可追溯到2 500多年前[1-2]。因其含有丰富的营养物质和特殊的风味在世界各地广为流传，发酵食品在我国也有着重要的意义。中华民族为了便于将肉类储藏，以及提高其可口性进而世代相传发展起来颇具特色的发酵肉制品。发酵肉制品在加工制作过程中伴随一定的微生物来发酵原料肉，是增加肉类中生物活性成分的天然途径之一[3]。但由于传统发酵肉制品在自然加工过程中存在加工时间长、脂类氧化变质、风味物质不稳定以及有毒有害物质易产生等问题，更加健康有新意的发酵肉制品的研究与开发造成了一些传统肉制品的地域特征风味丧失，传统发酵肉制品的食用和经济价值严重受损的同时，消费大众对发酵肉制品的安全性、所含营养价值以及风味色泽要求也越来越高。

发酵肉制品特有的风味主要由于肉类风干进程中的理化变化和微生物（外源性+内源性）参与肉类中脂肪和蛋白质分解、氧化等反应的变化，从而逐渐产生酯、醛、酮、酸等一系列小分子化合物，风干发酵时间的不断加长，微生物的作用也变得越来越显著[4-5]；我国传统发酵肉制品在形成独特的品质过程中含有大量的微生物菌群，这些微生物菌群起决定性作用。但这些微生物中如果部分有害菌在发酵过程中成为优势菌，则会影响发酵肉制品的最终食用品质。目前众多学者已在微生物多样性分析及运用微生物改善发酵肉制品品质等方面获得了重要进展[6-10]。本文通过综述发酵肉制品中微生物（降/不产生物胺菌株和产生物胺菌株）与生物胺形成的联系，在提高发酵肉制品中微生物资源利用率的同时保证发酵肉制品的品质安全性，为利用发酵剂调控微生物菌群结构来降低生物胺潜在危害的应用提供科学依据。

1 发酵肉制品中的微生物

发酵肉制品是指在自然或人工控制的低温条件下，对肉类进行一系列加工再加以辅料，进而生产出的肉制品。这个过程伴随微生物或酶的发酵作用，使其发生各种生物、化学、物理反应，为肉制品提供了不同的质地、颜色、风味以及贮藏条件[11-14]。微生物发酵是食品加工和保鲜中最古老和最实用的技术之一，因为是自然环境下发酵的肉制品，微生物群体区系比较复杂，肉制品中可能存在着大量的优良微生物菌株，肉制品借助部分有益微生物，使得原料肉中的蛋白质分解成为游离氨基酸后形成大量乳酸，导致肉制品的pH值降低，有害微生物的生长繁殖从而得到抑制，大大提高了其消化性、营养性、风味以及贮藏时间。而传统的肉类腌制工艺，既保留了天然的蛋白质来源，又提高了其感官品质，其中发酵是肉制品提升品质的措施之一。通过发酵将食品原料转化为稳定的食物在许多古代文化中很普遍，但未对生产过程中微生物进行成分分析。

目前，许多国家采用高通量测序的宏基因组学或通过16s/18s rDNA，ITS区域进行扩增测序等现代生物技术分析微生物群落测序、研究并监控优良发酵菌株在肉制品发酵过程中微生物的菌相变化。黄郑朝等[15]和TALON R等[16]均应用高通量测序技术，对传统发酵肉制品测序后进行了微生物多样性分析，研究表明发酵肉制品中微生物菌群多样性丰富。目前，发酵肉制品中的优势微生物主要有细菌菌群、霉菌菌群和酵母菌菌群等，这些微生物菌群在发酵肉制品成熟过程的不同阶段形成不同的菌群结构发挥不同的作用，对于发酵肉制品产品形成不同品质发挥着重要作用。自然发酵的菌群主要来自于产品本身及发酵时在环境中偶然获得的微生物，微生物的来源无法控制，一但有害菌得到繁殖形成优势菌群，将导致产品的质量无法控制，经常出现同一批产品在质量上差别很大。现如今，为了缩短产品生产周期的同时而保证产品的质量安全，在工业化批量生产中人工接种微生物逐渐取代了早期的自然发酵。微生物被作为外源发酵剂广泛使用，不同菌株间存在拮抗或协同作用，所以研究者难以明确发酵肉制品不同阶段的优势菌群，无法通过人工调控发酵肉制品的微生物菌群结构来把控发酵肉制品的品质安全。邓展瑞等[17-18]在研究陇西腊肉和哈尔滨风干肠制作过程中微生物存在情况时发现，在产品制作过程中乳酸菌数起主导作用，始终保持较高水平，其中主要以乳酸菌属为主。ELÍAS M等[19]研究表明，其中大多数情况下乳酸菌在发酵过程中都会成为优势菌，少数情况下为其它微生物。毕旺来等[20]研究得出烟熏腊肉储藏过程中主要的微生物为葡萄球菌。如果肉制品在发酵过程中不能够严格控制微生物，接种发酵剂从开始直到发酵结束，始终为优势菌[21]。Holko等[22]接种混合发酵剂制作羊肉香肠后，结果表明贮藏两个月后的羊肉香肠中嗜酸乳杆菌始终起主导作用，而动物双歧杆菌则已检测不到。贺稚非等[23]检测浙江金华火腿的微生物菌群结构复杂，火腿表面的霉菌与内部的葡萄球菌与乳酸菌区系之间互相作用相互影响，再一次证实了菌株间的拮抗或协同作用。所以发酵肉制品在自然发酵过程中，由于环境复杂发酵肉制品发酵及贮藏过程中菌群之间的竞争无法确定，优势菌群也随之发生变化，难以保证产品的质量以及安全。

由此可见，发酵肉制品中微生物菌群多种多样，菌群结构呈多样性，较常见的发酵微生物种类主要包括乳酸菌（Lactobacillus）、肠细菌（Enterobacteria）、酵母菌（Saccharomyce）及霉菌（Moulds）、葡萄球菌（Staphylococcus）和嗜冷杆菌（Psychrobacter）以及肉杆菌（Carnobacterium）的某些种。这些微生物可以被单独或复合使用，存在着菌群效应。发酵肉制品加工中很多优势菌的产生对发酵肉制品特有品质的形成有积极作用，但也有一些微生物（主要为杂菌），若不能很好地控制，将会破坏发酵肉制品应有的品质和风味。

2 发酵肉制品中的生物胺

生物胺（biogenic amines，BAs）是有机碱性含氮的、低分子量、热稳定、不易挥发的生物活性化合物，存在于植物、微生物和动物细胞中，广泛存在于食品中，尤其是发酵食品如发酵肉制品。包括色胺（tryptamine，TRP）、2-苯乙胺（2-phenylethylamine，PHE）、腐胺（putrescine，PUT）、尸胺（cadaverine，CAD）、组胺（histamine，HIS）、酪胺（tyramine，TYR）、亚精胺（spermidine，SPD）、精胺（spermine，SPE）等，生物胺的产生途径在发酵肉制品中有两条[24]。一是脂肪族生物胺在醛或酮的转氨作用下产生，二是主要形成于微生物对氨基酸的脱羧作用中，在蛋白酶的作用下使大分子蛋白质分解成游离氨基酸，原料肉中本身存在的或是在发酵过程中污染了与产胺相关的微生物。它的形成必须具备3个条件：氨基酸脱羧酶由微生物分泌而成；有氨基酸和寡肽成分大量存在；适合微生物生长的环境条件。在微生物氨基酸脱羧酶作用下，组胺、酪氨、尸胺等是由相对应的氨基酸前体物质发生脱羧反应生成的产物，相比于腐胺、精胺和亚精胺的多步反应形成来说比较复杂，形成过程如图1所示[25-27]。

图1 生物胺的形成途径Fig.1 Forming pathway of biogenic amine

生物胺（BAs）经常被作为各种肉类、鱼类、葡萄酒的质量指标，用以表征食品的新鲜度和/或变质程度[28]。BAs是一类对人体具有精神作用和一些精神类药物的作用结合点，然而人类的解毒系统不能消除过量的BAs，因此可能会造成多种生理效应。人体食用BAs含量超标的发酵食品，会引起过敏反应，如头疼、腹部痉挛、呕吐等不良生理状况反应，甚至会对人体的神经系统、肌肉造成极大的损伤和紊乱，甚至引起轻度抑郁[29-30]。但很难确定这些胺的毒性水平。此外，特别值得一提的是免疫力低下的脆弱人群，如老年人、儿童和婴儿，可能对低水平的BAs不耐受，并表现出更严重的症状。BAs对热不敏感，但若在含有亚硝酸盐和硝酸盐等固化剂以及经过热处理的条件下，有利于BAs和亚硝酸盐相互作用形成亚硝胺[31-32]。我国传统发酵肉制品的种类繁多，形式多样，地区来源不同、发酵和贮存条件不同，导致BAs的形成和降解途径不同。同时又由于自然发酵的传统肉制品生产条件难以控制，容易造成较大的产品质量差异，因此在工业化生产中传统发酵肉制品的产品安全把控会存在很多问题：第一是滋生污染食物的金黄色葡萄球菌；第二是产生引起食物中毒的肉类毒素；第三是制作过程中BAs的生产；第四是硝酸盐、亚硝酸盐、重金属离子等产生的毒性[33]。另外，原料肉在进行加工之前就可能被微生物污染，肉制品中BAs的毒性潜能不仅取决于人体快速清除的能力，还取决于食品中BAs的质量和数量，这就增加了BAs产生的风险性。原料肉及肉制品中常见且丰富的生物胺是酪胺、腐胺和尸胺，部分肉制品含有低含量的组胺、色胺、精胺和亚精胺，其水平在不同类型的产品之间有很大差异。

总生物胺可作为质量或安全系数使用，美国食品和药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）规定的生物胺限量标准建议总BAS＜1 000 mg/kg。KUNG等[34]对发酵香肠中的生物胺含量进行测定，结果发现13类产品中有2类BAs含量较高，其中有一种香肠的组胺含量为102 mg/kg，而美国对于发酵香肠中组胺含量规定为50 mg/kg，这远远超过FDA的标准。张海萍等[35-38]利用高效液相色谱丹磺酰氯柱前衍生法，分别以新疆自治区的44种熏马肠、30种四川香肠、6种不同类型发酵肉制品和7省（市）取样的42个传统中式香肠进行BAs含量的检测，结果表明：部分样品的BAs总量超过FDA规定的生物胺限量标准，其中色胺、酪胺和亚精胺含量均不同程度超过BAs的安全剂量标准，其中腐胺和尸胺含量与国外报道的生物胺含量安全标准范围基本一致，精胺在火腿中含量最高，存在一定的安全隐患。丁洪流等[39]对江苏省13市191批次腌腊肉制品进行抽检，生物胺平均浓度在种间存在显著差异。在191批次腌腊肉制品中，1批次组胺超过DB 3112004—2012《食品安全地方标准发酵肉制品》限量；1批次酪胺超过1 000 mg/kg，高达1 150 mg/kg。发酵肉制品由于原料和当地环境的差异，形成了具有地方特色的风味，而风味的生成与BAs存在密切关系，因此，在保留发酵肉制品独特风味的同时，如何控制发酵肉制品的生物胺含量是当今发酵肉制品的一大挑战。

3 微生物与生物胺的相关性研究

食品中BAs与发酵肉制品环境污染、微生物腐败以及贮藏环境卫生有关。食品中BAs的生成与发酵食品中的微生物菌群或者发酵食品的食用品质、感官风味品质、安全品质有关。因而使得研究学者在解决BAs问题上止步不前。研究发现发酵肉制品的微生物菌群结构可以解释发酵肉制品中BAs的测定浓度。原料肉及肉制品中常见的生物胺是酪胺、腐胺和尸胺，这些BAs主要由乳酸菌、肠杆菌、假单胞菌产生[40]。Halász等研究证明乳酸菌和乳酸片球菌均能产生多种胺类（组胺、尸胺、腐胺、酪胺、精胺和亚精胺），与BAs相关的芽孢杆菌属中的许多菌株都显示出一种或多种不产生物胺或降生物胺的能力，如弗氏柠檬酸（Citrobacter）、梭状芽孢杆菌（Clostridium）、克雷伯氏菌（Klebsiella）、嗜冷杆菌（Psychrobacter）、大肠杆菌（Escherichia coli）、变形杆菌（Proteus species）、假单胞菌 （Pseudomonadaceae）、沙门氏菌（Salmonella）、志贺氏菌（Shigella Castellani）、片球菌（Pediococcus Claussen）、链球菌（Streptococcus）、肠球菌（Enterococcus）及弧菌（Vibrio），且发酵产品中生物胺的生成量与微生物之间存在内在联系，菌株效应十分显著。其中大肠杆菌和假单胞菌可积累组胺、腐胺和尸胺。因此，BAs含量与非发酵食品的卫生质量差有关[41]。

自然发酵的传统肉制品，原料肉中的初始微生物与自然环境中微生物的相互竞争、适者生存，适应主体环境的微生物成为优势菌株。研究学者目前关注的重点主要在于分析生物胺潜在的毒性作用和对食品新鲜度的指示程度[42]，对生物胺的安全性[43-44]、分析检测[45-47]、形成及控制[48-50]均有较深入的研究。但对发酵肉制品的潜在危害物质——生物胺和微生物之间的内在关系缺乏足够的认识。早在20世纪40年代，研究者就发现生物胺的合成反应与微生物的代谢作用息息相关。如Gabastou等[51]在一个人的病例报告中发现游离氨基酸作为前驱物质，部分微生物在生长数天后会产生生物胺。细菌可以产生生物胺，同时提示生物胺可能与人体的精神状态有关[52]。微生物对生物胺的形成具有特异性，有研究表明组胺的形成离不开一些产气肠杆菌和哈夫尼肠杆菌的作用[53-54]。Teresa曾指出，肠细菌和假单胞菌属的增殖与尸胺、腐尸胺的形成有关[55]。近年来研究表明，微生物菌群结构在发酵香肠中的产胺能力各不相同，在不同环境下对生物胺含量有不同的影响，微生物菌群结构决定着发酵香肠生物胺的含量。如果自然环境中或食品自身存在某一特定菌株可能仅仅产生一种生物胺或同时代谢生成多种生物胺。添加单一或混合发酵剂可降低发酵肉制品的pH值和水分活度，从而改变其菌群结构[56-57]。Lu SHILING等[54]将乳酸菌+腐生葡萄球菌作为发酵剂对发酵香肠微生物菌群结构和生物胺的影响进行了研究，发现发酵香肠中不同微生物产生物胺的能力不同，表明乳酸菌发酵剂可以有效抑制本地菌群，再一次证实了微生物菌群结构决定着发酵肉制品生物胺的含量这一结论。

食品中的BAs由于其生理和毒理学效应，成为一个潜在的公共卫生问题。因此，选择国内典型的传统发酵肉制品进行研究，分析发酵肉制品加工及贮藏工程中的微生物菌群结构和生物胺的变化规律，探索微生物菌群结构对发酵肉制品中生物胺变化机理与积累的相互关系，建立生物胺含量、菌群结构的构效关系，对发酵肉制品的工业化开发具有重要意义。我们目前研究的重点应集中于确定BAs对消费者在食品中构成的真正毒性风险，不应局限于单一的胺类或食品，而应涵盖所有涉及的胺类和所有消费的食品。还应注意引起毒性的其它因素，如毒性增强剂（monoamine oxidase inhibitor，MAOI）的摄入、食物摄入所产生的协同作用等。虽然这些方面确实难以解决，但应该加以研究，并纳入未来的法规，以确保食品安全和消费者的健康。因此科学有效地鉴别发酵肉制品对于维护人类健康安全有重大意义。

3.1 发酵肉制品与不产/降生物胺微生物

有研究学者参考筛菌分离选择了不产/降生物胺的干酪乳杆菌后得出，干酪乳杆菌这株降生物胺的微生物菌株已被欧洲食品安全局列入安全合格推定（the qualifiedpresumptionofsafety，QPS）名单。其中ANL ERTAN[58]从冷熏猪肉香肠中筛选出了可以降解尸胺、腐胺的乳酸菌。陆永梅等[59]筛菌后选择了不产生物胺的肠膜明串珠菌来发酵香肠。朱志远等[60]在发酵香肠中添加了不同种类的发酵剂，研究分析成熟过程中生物胺生成量，结果表明添加混合发酵剂（香肠乳杆菌+肉糖葡萄球菌）可以有效抑制多种生物胺的生成，降低色胺、腐胺、尸胺、组胺的含量，混合发酵剂（肠膜明串珠菌+肉糖葡萄球菌）的添加可以抑制2-苯乙胺和酪胺的生成。Mah等[61]发现，木糖葡萄球菌可以协助其它菌株更好地发挥降胺效果。高文霞等[62-64]分别验证得出木糖葡萄球菌有助于戊糖片球菌和肉葡萄球菌发挥作用，进一步降低生物胺含量。

3.2 发酵肉制品与产胺微生物

微生物被认为是发酵肉制品中生物胺积累的主要原因，生物胺浓度与特定的产胺微生物的种类以及数量呈明显的正相关性。不同发酵肉制品其主要产胺微生物的种类有较大差异，不同地区的同一种发酵肉制品其产胺微生物的产生量也有很大差异。这可能是由于食品微生态引起的差异，而食品微生态主要包括原料不同、地区不同、加工工艺不同、以及贮藏环境不同所造成的。不新鲜的原料遇到某些微生物在低酸、低盐度或特殊条件下对外界环境作出协同作用，使产胺微生物在加工或贮藏过程中正常生长，造成发酵肉制品生物胺含量的增加。文献资料表明，发酵肉制品中产生生物胺的微生物种类繁多。一般主要从鱼类产品和发酵食品中分离、筛选产胺微生物，包括肠细菌、乳酸菌、肉杆菌、葡萄球菌、酵母菌。刘蕾等[65]从市售的云南腊肠中共分离得到52株细菌，其中43株具有产生物胺能力，其中的7株细菌产尸胺和组胺的能力较强，部分菌株产酪胺。谷思静[66]则在我国传统臭豆腐中筛选出了一株高产生物胺的酵母菌，表明蛋白质含量较高的食品存在产生物胺的酵母菌。李蕊婷等[67]从新疆熏马肠中筛选分离鉴定产胺微生物，发现的优势细菌中木糖葡萄球菌产苯乙胺量最高，含量为3831.50μg/mL。阮一凡等[68]在研究混菌发酵鸭腿时发现在贮藏35 d左右随着大肠杆菌数量的增加，生物胺的总含量逐渐上升。

由此可见，生物胺的形成与微生物的活动密不可分。发酵肉制品中生物胺的积累不仅与微生物存在正相关或负相关关系，而且二者之间存在着复杂的关系。微生物影响发酵肉制品中生物胺的形成，进而影响生物胺的含量。目前，生物胺产生能力还不能按物种分类，只能归属到菌株，因此生物胺的种类和含量与微生物菌株的差异相关，与微生物的种类无关。发酵肉制品中检出的微生物种类一览见表1。

表1 发酵肉制品中检出的微生物种类一览Table 1 Microbial species detected in fermented meat products

4 结语

近年来随着科技的进步，发酵肉制品在成为食品加工制品研究新热点的同时，关于发酵肉制品中生物胺的研究逐渐增多。国内外研究者综述了影响生物胺形成的各种因素，证明生物胺是一定能生成的，不受条件的限制。中国传统的肉制品历史悠久，可以满足人们不同类型和口味的需求，不同的地域环境使得肉制品发酵及贮藏条件有所不同，发酵肉制品的外界环境导致肉中微生物菌群结构不同可能导致生物胺形成及降解途径存在差异。但国内的相关研究主要集中于臭豆腐、海产品、腌干鱼类、酒类、酸菜等，且仅仅局限于生物胺含量测定以及降生物胺菌株的筛选分离。随着消费者对安全、高品质、少添加剂的加工产品的兴趣越来越深厚，推动了食品工业和食品安全的发展，因此不添加化学物质且安全的加工肉制品变得越来越热门，生物胺的降解及调控技术也将成为未来的研究重点。