古油松下地被及其对土壤细菌群落多样性的影响

孔维一，王雪涵，董 昆，葛雨萱

(北京市香山公园管理处，北京100093)

植物与土壤微生物是影响土壤碳、氮输入输出过程的重要因素[1]，地上植物的生长对地下土壤环境会产生一定程度的影响，如植物凋落物、根系分泌物质及改良土壤通气性等方面[2]。植被生态恢复是通过增加植被盖度、减少水土养分流失，经微生物对植物残体、根系分泌物产生作用，调节土壤理化性质、增加土壤酶活性及有机质含量，使植被与微生物形成相互调节的复合系统[3-5]。

研究表明[6]古树周边地被植物的生长对土壤中微生物总量有明显影响。不同的地上植物群落会影响地下土壤微生物的群落结构[7],土壤微生物又能通过自身的正向或负向反馈作用调节地上植物的种类构成和生长发育[8]。

本研究通过对古树油松下地被植物进行调查统计，并对古树油松下土壤细菌多样性进行研究，为古树下植被生态恢复及古树下土壤细菌群落多样性研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 地被植物调查

在香山公园内选取二级古树油松30株，于2019年、2020年连续2年的春季(4月至5月)和夏季(7月至8月)进行地被调查。以油松树体为圆心，调查半径2 m内生长地被植物状况，统计地被植物覆盖情况、海拔分布、花色、株高、出现频率(频数/总数)(表1)。

1.2 土壤样品采集

在香山公园内静翠湖、唳霜皋、昭庙、眼镜湖及碧云寺等区域，选取立地环境一致，不同地被状况的二级古树油松13株，其中无地被4株、人工地被4株及野生地被5株。在古树根际范围，去除土壤表层杂草、石砾，采集20 cm 深的地被根际土壤，过筛后装入无菌离心管内，每个样品3次重复。

1.3 土壤细菌16s rDNA V3-V4区基因PCR扩增引物

根据Chao Yang等的试验方法设计上下游引物[9]。上游引物5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'，下游引物5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。

表1 样品采集信息Tab.1 Sample acquisition information

1.4 PCR体系及程序

PCR体系：DNA模板30 ng，Forward Primer(5 μM) 1 μL,Reverse Primer (5 μM)1 μL，BSA 3 μL，2xTaq Plus Master Mix12.5 μL，ddH2O 7.5-X μL

PCR扩增程序采取：94 ℃预热 5 min；94 ℃保持30 s，55 ℃保持30 s，72 ℃保持60 s，28个循环；72 ℃保持7 min，使产物充分延伸；4 ℃保存。1%琼脂糖凝胶，170 V，电泳时间30 min。MiSeq文库构建、上机测序等工作由北京奥维森基因科技有限公司完成。

1.5 数据分析

原始数据下机以Fastq格式存储，将下机数据拼接，去除嵌合体以及短序列得到优质序列。对序列进行归类操作，按照序列97%相似性分为一个分类单元，使用RDP Classifier算法或blast等方法对OTU代表序列进行比对分析，并在各个水平(界、门、纲、目、科、属、种)注释群落物种信息。使用qiime对数据进行抽平处理，计算以下alpha多样性指数：Chao1(菌种丰富度指数)、observed species(随测序深度的增加，实际观测到的OTU个数)、PD whole tree(谱系多样性，数值越大，群落多样性越高)和 shannon(微生物多样性指数，值越大，群落多样性越高)。

2 试验结果与分析

2.1 古树油松地被植物调查结果

2.1.1 古树油松地被植物春季调查结果 2019年、2020年春季对香山公园内二级油松古树下地被植物进行调查，如表2所示，共有15个科、18个属、18个种地被植物，分布在110至309 m海拔之间，株高范围在3.2至49.2 cm之间，其中胡枝子、菊花脑、薹草、沙地柏为人工种植地被植物，其余均为野生地被植物。春季古树油松地被植物中，出现频率最高的前五种为抱茎苦荬菜、短尾铁线莲、求米草、胡枝子、菊花脑。

2.1.2 古树油松地被植物夏季调查结果 2019年、2020年夏季对香山公园内二级油松古树下地被植物进行调查，如表3所示，共有14个科、18个属、18个种的地被植物，分布在110～309 m海拔之间，株高范围在2.4～92.8 cm之间，其中菊花脑、胡枝子、薹草、沙地柏为人工种植地被植物，其余均为野生地被植物。夏季古树油松下地被植物出现频率最高的五种为：狗尾草、求米草、菊花脑、胡枝子、薹草和铁苋菜。

表2 古油松地被植物春季调查统计结果Tab.2 Statistics of ground cover plants ancient P. tabuliformis in spring

表3 古油松地被植物夏季调查统计结果Tab.3 Statistics of ground cover plants ancient P. tabuliformis in summer

2.2 古树油松土壤样品测序结果与数据质控

油松13份土壤样品共得到有效序列1 458 640条，优质序列1445316条，占有效序列条数的98%以上，如表4所示，优质序列长度在260～540 bp之间，多数集中在400～440 bp之间。

表4 油松土壤细菌序列拼接结果

随测序数据量的增加，样品稀释曲线趋于平坦，说明土壤细菌基因测序结果基本覆盖样品中绝大多数细菌的生物学信息，可以用于后续结果分析。

2.3 古树土壤细菌群落丰富度与多样性分析

由图1所示，SPSS分析表明，不同地被状况的3组样品在4项Alpha多样性指数上差异不显著。其中chao1指数显示YY组(油松野生地被)土壤样品的菌种丰富度最高，YW组(油松无地被)土壤样品的菌种丰富度最低。observed species指数和PD whole tree指数呈现相似规律性，YR组(油松人工地被)土壤样品的细菌群落多样性最高，YW组(油松无地被)土壤样品细菌群落多样性最低。

2.4 古树土壤细菌群落分类学组成分析

2.4.1 油松土壤细菌群落门水平的组成分析 根据测序结果分析发现(图2)，油松古树土壤样品中的细菌分属于41门、108纲、136目、271科、397属。在门水平上，相对丰度大于1%的依次为酸杆菌门、放线菌门、变形菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门、硝化螺旋菌、拟杆菌门、护微菌门、浮霉菌门、疣微菌门、厚壁菌门。3种地被状况的土壤样品中，优势菌门均为酸杆菌门、放线菌门和变形菌门，其中酸杆菌门相对丰度均最高，YW组酸杆菌门相对丰度为34%，YR组酸杆菌门相对丰度为33.75%，YY组酸杆菌门相对丰度为30.20%；其次为变形菌门，YW组变形菌门相对丰度为22.25%，YR组变形菌门相对丰度为21.50%，YY组变形菌门相对丰度为24%；第三为放线菌门，YW组放线菌门的相对丰度为19.25%，YR组放线菌门相对丰度为18.50%，YY组放线菌门相对丰度为21.40%。

2.4.2 油松土壤细菌群落科水平的组成分析 根据测序结果分析发现(图3)，相对丰度大于1%的依次为Blastocatellaceae Subgroup 4科、Gemmatimonadaceae科、0319-6A21科、Nitrosomonadaceae科、Desulfurellaceae科、Xanthomonadales Incertae Sedis科、Hyphomicrobiaceae科、Xanthobacteraceae科、Rhodospirillaceae科、Gaiellaceae科、Pseudonocardia ceae科、Micrococcaceae科、Sphingomonadaceae科、Planctomycetaceae科、Micromonosporaceae科。三种地被状况的土壤样品中，优势菌科为Blastocatellaceae Subgroup4科，其相对丰度占比最高，YW组Blastocatellaceae Subgroup4科相对丰度为8.85%，YR组Blastocatellaceae Subgroup4科相对丰度为8.91%，YY组Blastocatellaceae Subgroup4科相对丰度为8.07%；其次为Gemmatimonadaceae科，YW组Gemmatimonadaceae科相对丰度为2.8%，YR组Gemmatimonadaceae科相对丰度为2.79%，YY组Gemmatimonadaceae科相对丰度为3.15%；第三为0319-6A21科，YW组0319-6A21科的相对丰度为1.60%，YR组0319-6A21科相对丰度为2.55%，YY组0319-6A21科相对丰度为2.19%。

2.4.3 油松土壤细菌群落属水平的组成分析 根据测序结果分析发现(图4)，在属水平上，相对丰度大于1%的依次为RB41属、H16属、Gaiella属、Pseudarthrobacter属、Sphingomonas属。3种地被状况的土壤样品中，优势菌属为RB41属，其RB41属相对丰度占比最高，YW组RB41属相对丰度为7.07%，YR组RB41属相对丰度为7.01%，YY组RB41属相对丰度为6.74%；其次为H16属，YW组H16属相对丰度为0.94%，YR组H16属相对丰度为1.54%，YY组H16属相对丰度为1.32%；第三为Gaiella属，YW组Gaiella属的相对丰度为1.19%，YR组Gaiella属相对丰度为1.33%，YY组Gaiella属相对丰度为1.22%。

3 结论与讨论

整体来说，古树油松下地被常呈斑块状分布，地被丰富度不高，且长势一般，这与古树凋落物腐烂分解缓慢有关。根据调查结果发现，春季古树油松地被植物中，出现频率最高的为抱茎苦荬菜、短尾铁线莲、求米草、胡枝子、菊花脑。夏季古树油松下地被植物出现频率最高的为：狗尾草、求米草、菊花脑、胡枝子、铁苋菜和薹草。这其中胡枝子、菊花脑和薹草为人工种植地被，抱茎苦荬菜、狗尾草和铁苋菜三种野生地被绿期较短，短尾铁线莲为藤本，不便于养护管理，求米草为香山公园优势野生地被植物，植株矮小，根系发达，自身繁殖及覆地能力较强，能有效改善古树下地面斑秃状况，较适合推广应用。

利用高通量测序技术对香山公园内古树油松下地被根际土壤进行了细菌多样性分析及分类学组成分析。研究结果表明，无地被古树油松土壤样品细菌多样性低于人工地被组和野生地被组，说明地被植物对古树油松下土壤中的细菌有一定影响，可以提高土壤中细菌群落的丰富度，与高秀宏[10]的结果相似；人工地被组与野生地被组也存在一定程度差异，由分类学组成可以看出，野生地被组放线菌门相对丰度大于人工地被组，酸杆菌门相对丰度小于人工地被组，说明人为干扰会影响油松土壤细菌的构成，这一结果与薛亚芳[11]相似，人为干扰会使土壤中酸杆菌门的相对丰度增加，酸杆菌门常以贫营养方式生长[12],说明无地被状况的古树土壤生境营养物质较缺乏。

土壤微生物情况受多种因素影响，今后可开展土壤pH、EC值、含水量等理化性质与土壤微生物相关指标的研究，监测地被植物对古树生长环境变化的影响。