不同产地柴胡的HPLC指纹图谱与有效成分分析

董苏莹，杜灵均，王安琪，尹 鑫，周志杰，田晔林*

(1.北京农学院 园林学院，北京 102206；2.北京农业职业学院，北京 102442； 3.承德市农林科学院，河北 承德 067000)

柴胡作为常用的中药材之一，在中国使用历史悠久，具有解表和里、疏肝解郁、升举阳气之功效,为中医治疗少阳证的首选要药[1-5]。柴胡最早被记载是在《神农本草经》中，该书将中药材分为上、中、下三品，柴胡被列为上品[6-10]。《中国药典》2015年版一部收载的柴胡为伞形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狭叶柴胡B.scorzonerifoliumWilld.的干燥根，按性状不同，分别习称“北柴胡”和“南柴胡”[11]。据报道在全球约有200种柴胡属植物，主要在欧亚大陆及北非有分布[12]，中国已报道的柴胡属植物有42种，17个变种及7个变型[13]。1916年惠泽等报道了柴胡中的主要有效成分为柴胡皂苷[14]，其中柴胡皂苷a、d的生物活性最强。柴胡皂苷a是柴胡抗癫痫作用的主要生物活性成分，柴胡皂苷d具有抑制肝组织纤维化、抑制肝脏癌细胞增殖的功能[15]。皂苷类成分主要在柴胡的根部，而地上部分则很少[16]。

高效液相色谱法(HPLC)具有分离效能高，分析速度快等优点，被广泛用于定性定量分析中药材及其制剂有效成分[17]。由于中药的成分较为复杂，选用高效液相色谱法构建中药指纹图谱时，一般多采用梯度洗脱的方法，这样能够分开中药中的大多数成分，因而能更准确、充分地揭示中药的鉴别信息[18]。本研究以柴胡皂苷a和柴胡皂苷d为参照组分，通过HPLC法，对不同产地的柴胡进行指纹图谱研究，为柴胡的质量评价和种植提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

共收集了11个不同产地的柴胡样品(表1)(由田晔林副教授鉴定，保存于北京农学院园林楼)，测试样品为阴干处理的干燥的根。

表1 材料来源Tab.1 Origin of Bupleuri Radix

1.2 分析方法

1.2.1 仪器 研磨仪(Retsch GmbH MM400)、筛子(孔径0.25 mm)、超声波清洗器(昆山超声仪器公司)、旋转蒸发仪(RE-52)、高效液相色谱仪(Waters2695)、检测器(waters2998 PAD)、Venusil XBP C18(L)色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm，150 A)(天津艾杰尔生物公司)。

1.2.2 试剂 浓氨水、甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、蒸馏水、柴胡皂苷a标准品(E-0239)、柴胡皂苷d标准品(E-0240)(购自上海同田生物有限公司)。

1.2.3 溶液的制备 分别称取一定量的柴胡皂苷a、d对照品，加入甲醇，制成0.4 mg/L的柴胡皂苷a溶液，0.5 mg/L的柴胡皂苷d溶液，摇匀。

将柴胡用研磨仪打成粉末状，0.25 mm孔径过筛后称取0.5 g，置于50 mL塑料管中，加入25 mL含5%浓氨试液的甲醇溶液，密塞，超声处理(功率600 W,频率40 kHz)30 min，水温为30 ℃，滤过，用20 mL甲醇分为2次进行容器和药渣的洗涤，洗液与滤液混合，用旋转蒸发仪回收溶剂至干。加入适量甲醇溶解残渣，转移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用注射器吸取2 mL溶液，后用0.22 μm滤膜过滤至色谱进样瓶中，做好样品标记。

1.2.4 高效液相色谱测定 使用Venusil XBP C18(L)色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm，150 A)，以乙腈为流动相A，水为流动相B，等度洗脱，皂苷a A∶B=40∶60,皂苷d A∶B=45∶55；流速1.0 mL/min；柱温25 ℃；检测波长为210 nm。测定时精密吸取20 μL进行测定。

1.2.5 线性关系考察 取1.2.3中制备好的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d标准品溶液，将进样量分别设置为2.5 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，上机检测后以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。结果柴胡皂苷a回归方程为y=296 809x-35 248，R2=0.999 6，柴胡皂苷d回归方程为y=304 388x-94 946，R2=0.999 4。

1.2.6 精密度考察 取1.2.3中制备好的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d标准品溶液，设置每次进样量20 μL，连续6次进样，通过所得图谱进行计算。计算得出柴胡皂苷a的RSD为1.10%，柴胡皂苷d的RSD为0.75%，表明仪器精密度良好。

1.2.7 重复性考察 用1.2.3方法制备2号柴胡样品6份，设置每次进样量20 μL，连续6次进样。计算得出柴胡皂苷a的RSD为2.25%，柴胡皂苷d的RSD为3.27%，表明重复性良好。

1.2.8 稳定性考察 用1.2.3方法制备2号柴胡样品一份，分别在0 h、2 h、4 h、6 h、24 h、48 h进样进行上机检测，进样量20 μL。计算得出柴胡皂苷a的RSD为1.85%，柴胡皂苷d的RSD为0.50%，表明室温下混合对照品溶液在48 h内进行测定，试验结果稳定。

1.2.9 加样回收率考察 用1.2.3方法制备2号柴胡样品并加入1 mg柴胡皂苷a、柴胡皂苷d标准品制备成混合溶液，通过色谱仪进行检测，进样量20 μL。计算得出柴胡皂苷a的加样回收率为100.73%，RSD为1.65%；柴胡皂苷d的加样回收率为95.56%，RSD为1.02%。

1.2.10 不同产地柴胡HPLC指纹图谱的建立 利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件进行指纹图谱的建立及相似度计算，根据生成峰图进行试验数据分析，并验证试验的准确性。

2 结果与分析

2.1 不同产地柴胡皂苷a的含量及色谱图

通过高效液相色谱仪上机检测，11个不同产地的柴胡进样量均为20 μL，药用成分柴胡皂苷a含量测定结果如表2所示，色谱结果如图1所示。

从表2中可以看出，11个柴胡药材样品中柴胡皂苷a的含量从高到低依次是甘肃人工种植两年生柴胡(2.654%)、海升堂药店购买柴胡(1.705%)、河北承德人工种植两年生柴胡(1.449%)、陕西人工种植三年生柴胡(1.012%)、同仁堂药店购买柴胡(0.865%)、东北野生柴胡(0.553%)、河北承德人工种植三年生柴胡(0.389%)、山西人工种植两年生柴胡(0.302%)、隆化野生柴胡(0.222%)、丰宁野生柴胡(0.178%)、海拉尔野生柴胡(0.101%)。最后三个地点的柴胡皂苷a的含量未达到中国药典的标准。

表2 11个不同产地柴胡的柴胡皂苷a和皂苷d含量Tab.2 Contents of saikosaponin a in Bupleuri Radix from 11 different habitats

2.2 不同产地柴胡皂苷d的含量及色谱图

通过高效液相色谱仪上机检测，11个不同产地的柴胡的药用成分柴胡皂苷d含量测定结果如表2所示，色谱结果如图2所示。从表2中可以看出，11个柴胡样品中柴胡皂苷d的含量从高到低依次是甘肃人工种植两年生柴胡(3.287%)、陕西人工种植三年生柴胡(1.619%)、同仁堂药店购买柴胡(1.495%)、海升堂药店购买柴胡(1.490%)、河北承德人工种植2年生柴胡(0.756%)、东北野生柴胡(0.734%)、海拉尔野生柴胡(0.538%)、河北承德人工种植三年生柴胡(0.485%)、隆化野生柴胡(0.441%)、山西人工种植两年生柴胡(0.416%)、丰宁野生柴胡(0.115%)。仅丰宁的未达到中国药典的标准。

2.3 不同产地柴胡皂苷a和柴胡皂苷d总含量

通过对表2中柴胡皂苷a、d总含量的计算可以看出，不同产地柴胡的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d总含量在0.292%～5.941%之间，总含量最高的比最低的高出5.649%，其中甘肃人工种植两年生柴胡的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的总含量最高，为5.941%，丰宁野生柴胡的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的总含量最低，为0.292%。通过对表中的数据进行分析发现，来自河北地区的4个柴胡样品中，野生柴胡的柴胡皂苷a、d的总含量低于人工种植柴胡。还发现山西产柴胡的柴胡皂苷a、d的总含量低于甘肃产，这与余菁等[19]研究结果相一致。

《中国药典》2015年版一部中规定北柴胡的柴胡皂苷a、d的总量最低为0.30%[20]，分析实际所得数据发现，除丰宁野生柴胡以外，其他地区的总量均在0.30%以上，最高者可达5.941%。

2.4 不同产地柴胡皂苷a、d的HPLC指纹图谱匹配建立及相似度评价

分别以柴胡皂苷a、d标准品为参照图谱生成对照峰R(图3)，进行多点校正。通过色谱图上重叠峰进行对比，非共有峰所占比例较大。通过图谱之间对比，柴胡样品间皂苷含量和出峰时间存在明显

差异，是生长区域和生长环境不同导致的[6,21]。

将色谱图匹配到《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》中，通过相似度软件进行计算，结果如表3所示，与对照图谱进行对比，柴胡皂苷a的相似度在0.106～0.937之间，柴胡皂苷d的相似度在0.029～0.955之间。

表3 柴胡皂苷a、d相似度结果Tab.3 Similarity results of saikosaponin a and d

3 讨论与结论

3.1 柴胡皂苷含量与生长地域相关

本研究的11个样品分别来自于陕西省(1个)、甘肃省(1个)、河北省(4个)、内蒙古(1个)、山西省(1个)、北京(2个)和东北地区(1个)。通过数据分析可以发现，11个产地柴胡的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量存在差异。其中甘肃省、陕西省柴胡的柴胡皂苷含量较高，与王砚等的研究得出的西北地区柴胡品质较高相一致[22]。有文献报道指出药材生长环境不同，温度、湿度和光照会对药用植物成分积累产生较大影响[23],环境的差异是造成不同产地柴胡含量的不同的主要原因[6,22]。

3.2 柴胡皂苷含量与生长方式相关

本研究采集的样品有人工种植样品和野生样品。其中S1、S2、S4、S8、S9为人工种植样品，S3、S5、S10、S11为野生样品，S6、S7未知。人工种植样品的柴胡皂苷含量均达标，而野生样品中丰宁地区的柴胡皂苷含量未达标。通过对柴胡皂苷含量的对比发现，人工种植柴胡的柴胡皂苷含量明显高于野生柴胡的皂苷含量，这与杨洋的研究结论一致，即人工种植的柴胡从色泽、形状、品质到适应性均优于野生柴胡种[24]，但野生柴胡资源仍作为主要资源应用于市场。

3.3 柴胡皂苷含量与生长年限相关

本研究中人工种植柴胡有两年生和三年生。其中S2、S4、S8为两年生，S1、S9为三年生，S6、S7未知。通过对比发现，各样品间柴胡皂苷含量差异显著，甘肃两年生的柴胡皂苷含量最高，河北承德人工种植两年的柴胡品质优于三年的，野生样品生长年限不详。建议甘肃和河北承德地区种植的柴胡两年采收，既可以提高土地利用率，也可以降低柴胡根腐病的发生，提高柴胡的品质。

通过对色谱图的相似度分析发现样品间化学成分相似度极高，说明样品全部为中药材柴胡，但对重叠峰进行对比可以发现，柴胡样品的非共有峰所占比例较大，表明各样品间差异明显。这不仅反映出柴胡中药用成分的质量含量在不同产区有一定的差异，也反映了柴胡在中药材市场中存在质量不一的情况。有利于市场北柴胡的质量监督[13]。

柴胡皂苷a含量最高的是来源于甘肃的柴胡，含量为2.654%，最低的是海拉尔野生柴胡，含量为0.101%；柴胡皂苷d含量最高的是甘肃柴胡，含量为3.287%，最低的是丰宁野生柴胡，仅0.115%。野生柴胡的含量没有人工种植的含量高，建议规范柴胡人工种植技术，其中西北地区柴胡品质优良，建议在西北地区建立种植基地。