贝那普利对心阳虚模型大鼠心功能相关指标的影响

郭雨楠，霍艳颖，吴实权，梁冰冰，张云茜，赵一帆， 周常喜，安 蕊，马洪海，姜代勋*，霍桂桃

(1.北京农学院 动物科学技术学院/兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京102206； 2.中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心，北京100176)

贝那普利(Benazepril)是第三代血管紧张素转换酶抑制剂，通过阻遏血管紧张素Ⅰ转换为血管紧张素Ⅱ，起到扩张血管、降低血压、减轻心脏负荷等作用，广泛用于人的高血压和心功能不全等的治疗[1,2]。随着人们生活水平的提高及宠物诊疗行业的发展，犬猫等宠物寿命普遍延长，心脏病等老龄化疾病逐年增多。由于宠物专用心脏病药品的缺乏，欧洲在2012年批准了贝那普利用于宠物临床，国内近年也有相应的贝那普利产品上市，用于犬心力衰竭及犬猫慢性肾病等的治疗。研究表明，贝那普利对犬慢性心力衰竭、扩张性心肌病等有明显效果[3-5]。心力衰竭犬临床常常出现心肌收缩力减弱，心脏排血量减少，静脉回流受阻，动脉供血不足，全身血液循环障碍及体温降低等症状[6]。依据心阳虚证的诊断标准：心功能减退和虚寒证[7]，可知临床上多数心力衰竭犬具有心阳虚证的特点。就此以阿霉素联合冰水浴冷刺激法制备心阳虚大鼠模型，探明贝那普利对其临床症状和心功能相关指标心电图ST段、心率、心肌酶以及心肌组织病理学的影响，为其在临床上对宠物心阳虚证的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

SPF级雌性Sprague Dawley(SD)大鼠40只，6周龄，质量160～170 g，购于斯贝福生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016—0002。大鼠在清洁级环境中分组分笼饲养，每天灯光照射12 h，室内温度(25±2) ℃，相对湿度55%±5%。给予充足饲料和饮用水，大鼠饲料购自斯贝福生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2015—0015，饮用水为煮沸并恢复至室温的自来水。所涉及的动物试验均按北京农学院动物福利与伦理委员会规定进行(批准号：BUAJDX2019001)。

1.2 主要材料

注射用盐酸多柔比星(批号bzl020766)购于山西普德药业有限公司，贝那普利(F5，批号34076)购于瑞士诺华制药有限公司，心肌酶谱测试片(AST、ALT、LDH、CK批号分别为 6847513、4305921、4163275、6205317)购于爱德士生物科技公司。真空采血针(批号20170606)购于浙江康德莱医疗器械股份有限公司，肝素锂抗凝真空采血管(批号19076101)购于河北鑫乐医疗器械科技股份有限公司，0.9%氯化钠注射液(批号201901216)购于辰欣药业股份有限公司。

1.3 动物处理

大鼠按随机数字表法分为对照组、模型组和贝那普利组，分别为10、15和15只大鼠。对照组大鼠在第1、8、15、22、29和36 天腹腔注射氯化钠注射液，2 mL/kg质量。模型组及贝那普利组大鼠采用阿霉素联合冰水浴冷刺激法制作心阳虚大鼠模型：大鼠在第1、8、15、22、29和36 天腹腔注射2 mL/kg盐酸多柔比星(主要成分为阿霉素，用前以氯化钠注射液配成2 mg/mL)，总给药量24 mg/kg质量；注射盐酸多柔比星期间，每天将大鼠置于冰水(0±2 ℃)中游泳3 min，每天1次，连续6周，冰水浴后用干毛巾将大鼠擦拭干净。造模同时，模型组和贝那普利组大鼠分别每天灌胃等量饮用水和贝那普利，连续6周，经口灌胃量按0.5 mL/100 g体质量计算。根据犬贝那普利使用量5 mg/5～10 kg，按平均质量换算得到大鼠贝那普利用量为0.3 mg/kg。造模期间，观察各组大鼠临床状况。

1.4 检测指标

1.4.1 心电图及心率测定 各组大鼠每周进行1次心电图检测(第0、7、14、21、28、35和42天)。大鼠按0.3 mL/100 g质量腹腔注射1%戊巴比妥钠进行麻醉，麻醉前禁食12 h。待大鼠进入麻醉状态将其仰卧固定于平台上，四肢常规消毒后，用一次性无菌针灸针刺入右前肢及双后肢皮下，使用多道生理信号采集处理系统(成都仪器厂，型号RM6240)通过Ⅱ导联将生物电缆连接至大鼠肢体上的针灸针上。记录每只大鼠3 min内的心电图波形，每隔2 min进行1次心率测定，共测定3次，计算平均值。

1.4.2 心肌酶检测 试验第42天，记录各组大鼠心电图后，对麻醉状态下的大鼠进行常规消毒，随后沿腹正中线剪开腹腔，暴露腹主动脉，用真空采血针采集1.5 mL血液，置于肝素锂抗凝的真空采血管中，2 000 r/min离心10 min后取上清，应用生化分析仪(爱德士生物科技公司，型号Catalyst Dx)进行心肌酶指标丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)活性检测。

1.4.3 心脏组织病理观察 试验第42天，各组大鼠采血后，通过腹主动脉放血处死大鼠，迅速摘取心脏并置于4%多聚甲醛中固定，常规方法包埋、切片(厚度为3～5 μm)和HE染色处理，使用光学显微镜(Olympus, 型号BX51)观察制备好的切片并采集图像。

1.5 统计分析

数据主要以柱形图+标准差表示，采用方差齐性检验和t-检验分析模型组与对照组或贝那普利组差异显著性，P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 临床观察

造模结束后，模型组大鼠与对照组比较临床表现出精神萎靡、活动量减少、畏缩扎堆、大便稀溏、体温降低、采食量减少等虚寒症状。与模型组比较，贝那普利组大鼠临床精神良好、较活跃、无畏缩扎堆、大便正常等，虚寒现象明显好转(表1)。

表1 临床观察结果Tab.1 Results of clinical observation

2.2 心电图ST段变化

与对照组比较，模型组大鼠心电图ST段呈抬高趋势，造模第35、42天，模型组大鼠ST段明显抬高，差异极显著(P<0.01)。贝那普利组大鼠与模型组比较ST段呈回落趋势，用药第7、14、35和42天，贝那普利组大鼠心电图ST段明显回落，差异显著或极显著(P<0.01/P<0.05)(图1)。

2.3 心率变化

与对照组比较，模型组大鼠心率呈降低趋势，造模第14、21、28、35和42天，模型组大鼠心率明显降低，差异显著或极显著(P<0.05/P<0.01)。贝那普利组大鼠与模型组比较心率呈一定的增加趋势，用药第14、35天，贝那普利组大鼠心率明显增加，差异极显著(P<0.01)(图2)。

2.4 心肌酶变化

与对照组比较，模型组大鼠心肌酶指标ALT、AST、CK、LDH均明显升高，差异显著或极显著(P<0.05/P<0.01)。贝那普利组大鼠与模型组比较ALT、AST、LDH、CK均明显降低，差异显著或极显著(P<0.05/P<0.01)(图3)。

2.5 心脏组织病理学变化

对照组大鼠心肌细胞形态正常，排列整齐。模型组大鼠M1中箭头处可见心脏间质单个核细胞浸润；M2中箭头处可见心肌细胞空泡变性；M3中上箭头处可见心肌变性，下箭头处有大量单个核细胞浸润。贝那普利组大鼠心肌细胞形态正常，排列整齐；F2、F3中箭头处为心脏间质单个核细胞浸润(图4)。

3 讨 论

阿霉素是抗肿瘤药物，因与心肌亲和力较高，所以对心脏的毒性作用较大，常被用于制备动物心病模型。单用药物可以损伤心肌，导致心功能减退，但难以体现虚寒的特点。余洪等以阿霉素结合低温刺激方法(将动物置于-4 ℃至-2 ℃冰柜中)制作心阳虚模型，造模时间短，成功率高[8]。为进一步损伤阳气，在余洪等基础上对心阳虚模型进行了改良：阿霉素诱导不变，低温刺激方法由原来的“气冷”改为“水冷”(-2 ℃至2 ℃冰水浴游泳)。该法既可给予大鼠强烈的寒冷刺激，又可消耗体力，造成虚寒。结果表明心阳虚模型大鼠出现畏缩扎堆，大便稀溏，体温降低等虚寒症状。应用贝那普利后，大鼠精神状态良好，被毛光泽，无畏缩扎堆，大便正常，采食量及活动量也增加，虚寒症状改善。

心电图是临床诊断心病的常用方法。通过心电图波形变化可分析心律异常、心肌受损程度以及房室功能障碍等情况。心电图ST段是QRS波群终点到T波开始前的一段，即心室去极化全部完成到快速复极化尚未开始的阶段，正常情况处于等电位线上。ST段异常抬高提示心肌缺血和梗死，而且ST段抬高形态不同提示心肌缺血部位或损伤程度存在差异[9, 10]。模型组大鼠ST段从造模第7天开始呈抬高趋势，在第35、42天时ST段异常抬高(P<0.01)，提示模型组大鼠心肌出现损伤。贝那普利组大鼠ST段从造模第7天开始呈回落趋势，在第7、14、35和42天，ST段明显回落(P<0.01/P<0.05)，提示贝那普利可有效对抗“阿霉素+水冷”刺激对心脏造成的损伤，与张瑾研究贝那普利降低冠心病患者心电图ST段、改善心肌缺血损伤的结果一致[11]。

心率变化与心脏功能和疾病发展密切相关：急性心肌梗死后心率增快发生心绞痛几率增加，而减慢心率可预防心绞痛的发生[12]；心率控制是冠心病心绞痛的重要治疗手段，心率过低可诱发自发性心绞痛[13]；积极控制心率也可降低慢性心衰患者炎症因子水平，改善心功能[14]。模型组大鼠从14天开始心率显著降低(P<0.01/P<0.05)，这与普萘洛尔诱导心阳虚大鼠及甲状腺全切除诱导阳虚兔等阳虚模型动物心率降低的结果一致[15,16]。贝那普利可显著提高模型大鼠心率(P<0.01)，与其提高链脲佐菌素诱导的糖尿病模型大鼠心率的结果一致[17]。此外，贝那普利也可降低心力衰竭患者心率[18,19]。因此，贝那普利或对心率具有双向调节作用，其机制需进一步研究。

心肌酶是存在于心肌组织中的多种酶的总称，主要包括LDH、CK、AST、ALT等。当心肌出现损伤时，心肌酶被释放到血液中，使血浆中酶活力升高。模型组大鼠血浆LDH、CK、ALT、AST含量明显升高(P<0.01/P<0.05)，提示模型组大鼠心肌出现了损伤。贝那普利显著降低了大鼠ALT、AST、LDH、CK活性(P<0.01/P<0.05)，与其降低肿瘤药致慢性心衰病人CK、LDH及充血性心衰模型犬LDH、CK、AST活性等结果相同[20,21]。

组织病理学检查是疾病诊断及评价药物毒理或疗效的重要依据。阿霉素诱导的模型组大鼠心脏出现单个核细胞浸润、心肌细胞空泡变性和心肌变性，与阿霉素诱导的急、慢性心脏毒性模型大鼠心肌病理学变化相似[22,23]；而贝那普利组大鼠心肌细胞形态正常，排列整齐，仅心脏间质有极轻度的单个核细胞浸润，提示贝那普利对阿霉素诱导的心肌损伤具有保护作用。

综上可知，贝那普利通过抑制心电图ST段异常抬高、增加心率、降低心肌酶活性及改善心肌损伤减轻了“阿霉素+水冷”诱导的心阳虚模型大鼠的虚寒症状，对其具有良好的预防和保护作用。