LINC00261和miR-522-3p在结直肠癌中的表达及其与患者预后的关系

赖志亨，邹 江

海南省中医院肛肠科，海南海口 570203

结直肠癌是全球发病率仅次于肺癌和乳腺癌的第三大癌症，其病死率仅次于肺癌，每年导致约60万例肿瘤相关病例死亡[1]。虽然结直肠癌的治疗有效率在不断提高，但是患者的生存率和生存质量仍然不尽如人意，因此急需研究新的治疗方法[2]。结直肠癌是一种复杂的多基因疾病，其具体的发病机制尚未完全明确。长链非编码RNA(lncRNA)在肿瘤发生和发展的过程中起着至关重要的作用，许多研究已经证实lncRNA异常表达是结直肠癌发病的重要调控机制之一[3-4]。LINC00261是肿瘤相关lncRNA之一，在非小细胞肺癌和肝细胞肝癌等肿瘤中发挥抑癌因子的作用[5-6]。lncRNA通常作为竞争性内源RNA(ceRNA)结合微小RNA(miRNA)发挥作用[7]。在非小细胞肺癌中LINC00261通过与微小RNA-522-3p(miR-522-3p)直接结合发挥抑癌作用[8]。miR-522-3p是新近发现的miRNA，其可有效促进骨肉瘤细胞的生长[9]。目前LINC00261、miR-522-3p与结直肠癌关系的研究较少，二者在结直肠癌中是否具有调控作用尚不清楚。本研究旨在探讨LINC00261和miR-522-3p在结直肠癌中的表达及相关性，并分析了二者与患者预后的关系，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2013年1月至2014年12月在本院行手术治疗的结直肠癌患者为研究对象。共纳入结直肠癌组织标本68例和其配对的癌旁组织标本68例。患者年龄36～75岁，平均(65.51±8.38)岁；男42例，女26例；部位：结肠38例，直肠30例；肿瘤最大径：≤5 cm 50例，>5 cm 18例；浸润深度：T1 33例，T2 21例，T3 10例，T4 4例；分化程度：高分化30例，中分化26例，低分化12例；临床分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期21例，Ⅲ期20例；淋巴结转移：无21例，有47例。本研究经本院伦理委员会审核通过，患者及家属均签署知情同意书。纳入标准：(1)患者均初次进行手术治疗，且未接受过其他任何形式的抗肿瘤治疗；(2)均获得手术切除组织，并经病理专家证实为结直肠癌组织和癌旁组织；(3)具有完整的临床病理资料和随访资料。排除标准：(1)发生远处器官转移；(2)合并有其他类型的肿瘤；(3)合并有严重器质性疾病者。

1.2仪器与试剂 Trizol试剂购自北京天漠科技开发有限公司，氯仿、异丙醇和无水乙醇购自天津风船化工有限公司；DEPC水购自上海生工有限公司；Nanodrop2000购自美国Thermo公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit逆转录试剂盒和SYBR Premix Ex TaqTMⅡPCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；LINC00261、miR-522-3p和内参U6引物由美国Invitrogen有限公司合成。7500实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1实时荧光定量PCR 手术切除的结直肠癌组织和癌旁组织立即冻于液氮中，采用研钵将其研磨后加入Trizol试剂1 mL裂解，移至EP管后加入氯仿200 μL混匀静置5 min，4 ℃高速离心30 min，吸取最上层水相层溶液450 μL与等体积的异丙醇混匀后4 ℃高速离心30 min，可见EP管底部白色沉淀为RNA，无水乙醇洗涤两次，加入DEPC水溶解RNA，测得RNA纯度(A260 nm/A280 nm为1.8～2.0时，纯度较高)和浓度。按照逆转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit说明书配制逆转录反应体系：5×PrimeScript Buffer 24 μL，PrimeScript RT Enzyme mix Ⅰ 1 μL，Oligo dT primer 1 μL，Random 6 mers 1 μL，总RNA 0.5 μg，RNase Free H2O补足20 μL，37 ℃ 15 min，85 ℃ 30 s将总RNA逆转为cDNA。

以cDNA为模板，按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ PCR试剂盒说明书配制qRT-PCR反应体系，cDNA模板2 μL、ddH2O 2 μL、引物F 0.4 μL、引物R 0.4 μL、ROX Reference Dye 0.2 μL，SYBR Premix EX TaqTMⅡ 5 μL，总体积10 μL。扩增反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。7500实时荧光定量PCR仪上机检测各样品的循环阈值(Ct)。采用2-ΔΔCt公式以U6基因为内参，计算LINC00261和miR-522-3p的相对表达量。LINC00261引物F：5′-ACA TTT GGT AGC CCG TGG AG-3′；R：5′-TCT TCC CCG GAG AAC TAG CA-3′。miR-522-3p引物F：5′-GGG CTC TAG AGG GAA GCG C-3′；R：5′-CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3′。内参U6引物F：5′-CTT CGG CAG CAC ATA TAC T-3′；R：5′-AAA ATA TGG AAC GCT TCA CG-3′。

1.3.2随访方法 患者术后采用电话询问或者门诊查询的方式每隔3个月随访1次，直至患者死亡或者完成5年随访时间时截止。

2 结 果

2.1LINC00261和miR-522-3p在结直肠癌组织中的表达水平 LINC00261在结直肠癌组织中的表达水平低于其在癌旁组织中的表达水平(P<0.05)，miR-522-3p在结直肠癌组织中的表达水平高于其在癌旁组织中的表达水平(P<0.05)，见表1。

表1 LINC00261和miR-522-3p在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达水平

2.2结直肠癌组织中LINC00261、miR-522-3p表达水平与患者临床病理参数之间的关系 LINC00261在结直肠癌组织中的表达水平与患者的性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤最大径和浸润深度均无关(P>0.05)，与分化程度、临床分期和淋巴结转移情况相关(P<0.05)。miR-522-3p在结直肠癌组织中的表达水平与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤最大径、浸润深度和分化程度均无关(P>0.05)，与临床分期和淋巴结转移情况相关(P<0.05)。见表2。

表2 LINC00261和miR-522-3p在结直肠癌组织中的表达水平与临床病理参数之间的关系

2.3结直肠癌组织中LINC00261、miR-522-3p表达水平对患者预后的影响 对68例结直肠癌患者进行随访，其中35例死亡，33例存活，5年生存率为48.53%。

根据LINC00261在结直肠癌组织中的表达水平分为LINC00261高表达组(>0.64，32例)和LINC00261低表达组(≤0.64，36例)。LINC00261高表达组的5年生存率为65.63%(21/32)，LINC00261低表达组的5年生存率为33.33%(12/36)。绘制Kaplan-Meier生存曲线，Log Rank检验分析显示LINC00261低表达组的预后比LINC00261高表达组预后更差(χ2=5.762，P=0.021)。

根据miR-522-3p在结直肠癌组织中的表达水平分为miR-522-3p高表达组(>1.79，33例)和miR-522-3p低表达组(≤1.79，35例)。miR-522-3p高表达组的5年生存率为36.36%(12/33)，miR-522-3p低表达组的5年生存率为60.00%(21/35)。绘制Kaplan-Meier生存曲线，Log Rank检验分析显示miR-522-3p高表达组的预后比miR-522-3p低表达组的预后更差(χ2=8.710，P=0.016)。

2.4多因素Cox回归分析结直肠癌患者预后不良因素 建立Cox比例风险回归模型，以本研究资料为样本，以直肠癌患者预后状况为应变量，赋值1=死亡，0=生存，t=生存期。经临床和统计专家讨论决定，以LINC00261和miR-522-3p表达及表2中P<0.10的指标/因素为自变量。此外，为提高统计效率并使回归结果清晰，将原为连续数值的LINC00261和miR-522-3p表达指标，按其均值进行分段(分层)，转化成高和低表达的两分类变量。各变量赋值如下：分化程度中，1为低分化，0为中高分化；临床分期中，1为Ⅲ期，0为Ⅰ+Ⅱ期；淋巴结转移中，1为有，0为无；LINC00261表达中，1为LINC00261表达水平<0.64，0为LINC00261表达水平≥0.64；miR-522-3p表达中，1为miR-522-3p表达水平>1.79，0为miR-522-3p表达水平≤1.79。回归过程采用逐步后退法，以进行自变量的选择和剔除，设定α剔除=0.10，α入选=0.05。多因素Cox回归结果显示，高临床分期、低分化程度、淋巴结转移、LINC00261低表达和miR-522-3p高表达是结直肠癌患者预后不良的独立危险因素(P<0.05，HR>1)，见表3。

表3 多因素Cox回归分析结直肠癌患者预后不良的独立危险因素

2.5LINC00261和miR-522-3p在结直肠癌组织中表达的相关性 Pearson相关分析显示，LINC00261与miR-522-3p在结直肠癌组织中的表达水平呈负相关(r=-0.422，P<0.001)。

3 讨 论

结直肠癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，发病率和病死率均较高，随着饮食习惯的改变和生活压力的增加，结直肠癌的发病率呈上升趋势[10]。手术是结直肠癌最有效的治疗方法，主要针对结直肠癌早期患者，约90%的结直肠癌早期患者可以通过手术治愈，患者的5年生存率约为90%[11]。但是结直肠癌的早期症状不明显，大多数患者确诊时已经处于中晚期，出现病灶转移，治疗方式为手术切除原发病灶和转移病灶，辅助化学治疗和放射治疗，但治疗效果不佳，晚期结直肠癌患者5年生存率仅10%[2]。通过靶向治疗与结直肠癌进展相关的关键分子，可以改善结直肠癌患者的预后，瑞戈非尼、阿帕替尼、呋喹替尼及安罗替尼等小分子靶向药物已经在晚期结直肠癌治疗中取得了较好的疗效[12]，但是存在耐药现象，仍然达不到理想的疗效，因此研究结直肠癌发生发展过程中的关键分子，探讨结直肠癌新的治疗靶点具有重要的临床意义。

lncRNA是长度超过200个核苷酸的RNA，参与细胞凋亡、细胞分化、肿瘤发生和转移的调控[13]。lncRNA可充当癌基因和抑癌基因，在肿瘤生长中发挥关键作用，并可以作为调控肿瘤进展的分子靶点[14]。LINC00261可在结直肠癌中发挥抑癌作用，ZHOU等[15]采用原位杂交发现，LINC00261在结肠癌组织中表达的阴性率高于其附近非癌组织，并与结肠癌患者的临床分期相关，LINC00261表达水平降低是影响结肠癌患者术后无复发生存时间的独立危险因素。本研究结果发现，与癌旁组织相比，LINC00261在结直肠癌组织中表达水平降低，LINC00261的表达水平与分化程度、临床分期和淋巴结转移相关，与ZHOU等[15]的报道基本一致，这提示LINC00261可能参与了结直肠癌的进展。另一方面，LINC00261低表达组的预后较差，LINC00261低表达是结直肠癌患者预后不良的独立危险因素，这表明LINC00261可作为预后判断的分子标志物。

miR-522-3p在慢性炎症中首次被报道[16]，目前的研究较少，炎症与结直肠癌的发生发展密切相关，但其能否通过调节炎症反应参与结直肠癌的进展尚不清楚。本研究发现，与癌旁组织相比，miR-522-3p在结直肠癌组织中表达增加，其表达水平与临床分期和淋巴结转移情况相关，且miR-522-3p高表达的结直肠癌患者的预后较差，miR-522-3p高表达是患者预后不良的独立危险因素。这表明miR-522-3p可能参与结直肠癌的恶性进展，是患者预后不良的分子标志物。SHUAI等[17]报道在结直肠癌组织和细胞系中miR-522-3p的表达增加，miR-522-3p过表达促进细胞增殖，降低细胞凋亡率，发挥促癌基因的作用。CHEN等[9]研究发现，miR-522-3p在骨肉瘤中亦呈异常高表达状态，且miR-522-3p高表达的患者的预后较差。

miRNA是lncRNA重要调控机制之一，且一个lncRNA可靶向调控多个miRNA，YAN等[18]报道LINC00261在结肠癌细胞中表达水平降低，过表达LINC00261可靶向调节miR-324-3p的表达抑制结肠癌细胞的增殖和迁移、侵袭能力，促进细胞凋亡，进而影响结肠癌的进展。此外，在非小细胞肺癌中LINC00261通过调节miR-522-3p抑制肿瘤的发生发展[8]，而LINC00261是否调控miR-522-3p的表达参与结直肠癌的疾病进展尚不清楚。本研究采用Pearson相关分析发现，LINC00261和miR-522-3p在结直肠癌组织中表达水平呈负相关，lncRNA可竞争性抑制miRNA，因此推测LINC00261可能是通过抑制miR-522-3p在结直肠癌组织中发挥作用，但是具体的作用机制将在后续的细胞水平中进行研究。

综上所述，结直肠癌组织中LINC00261低表达，miR-522-3p高表达。LINC00261和miR-522-3p均与结直肠癌患者不良病理参数和预后相关，两者在结直肠癌组织中表达水平呈负相关。LINC00261和miR-522-3p是结直肠癌患者潜在的预后标志物和治疗靶标。