qRT-PCR法用于检测模拟环境表面载体HBV DNA的可行性研究*

陶西萍，来春艳△，赵 娜，魏晨波，薛卫宁，郭晓波

陕西省西安市中心医院：1.医院感染管理科；2.血液病研究所，陕西西安 710003

感染性疾病病原体可以通过呼吸道、接触等途径传播，污染的环境表面是间接接触传播的重要媒介，特别是在传染病流行期间，公共场所、医疗机构环境表面的污染状况及传播风险不容忽视，有文献报道，在手足口病/疱疹性咽峡炎独立接诊候诊区，医院环境肠道病毒污染阳性率为47.50%，环境表面肠道病毒污染有传播的风险，但我国尚无环境表面病毒污染状况检测标准，探索科学、可行的检测方法成为一项重要课题[1]。有学者运用ELISA法检测环境表面乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)来证实环境表面存在HBV污染，但无法判断检测样本是否具有感染能力，对于环境表面的清洁消毒、感染防控指导意义较小[2-3]。实时荧光定量PCR法(qRT-PCR法)目前已广泛用于临床血液样本中多种病毒的检测，但由于无相关技术标准，较少用于环境表面病毒的检测[4]。本研究用HBV载体模拟环境表面，并探索性应用qRT-PCR法检测HBV DNA，以验证qRT-PCR法用于环境表面病毒核酸检测的可行性。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器 采样液(天津灏洋华科生物科技有限公司生产，主要成分为氯化钠、氯化钾、葡萄糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、庆大霉素及两性霉素)、生理盐水；4种HBV标准品(浓度分别为5×106、5×105、5×104、5×103IU/mL)；HBV核酸测定试剂盒(荧光PCR法，上海之江生物科技股份有限公司)；Autrax全自动核酸提取站；SLAN-96P型荧光定量PCR仪等。

1.2方法

1.2.1环境表面HBV载体的制备 载体制备：将非光滑的PVC塑料板剪成5 cm×5 cm大小，首先用流动水清洗、2 000 mg/L含氯消毒剂浸泡30 min后清洗、擦拭、晾干后作为试验对象。HBV载体制备：应用移液枪分别吸取5×106、5×105、5×104、5×103IU/mL的HBV标准品100 μL于不同载体上，用棉签涂抹均匀，自然干燥，制备成4种浓度HBV标准品污染的载体。选用两种浓度(5×106IU/mL和5×104IU/mL)的HBV标准品污染的载体，分别用运送培养基和生理盐水进行采样，相同浓度、相同采集液重复3次，共计12个标本，检测载体表面HBV DNA浓度，取均值进行比较分析。

1.2.2采样方法 参照医院消毒卫生标准中物体表面微生物采样方法[5]，用浸有运送培养基棉拭子1支，在模拟载体表面横竖往返各涂抹5次，并随之转动棉拭子，折去手接触部分，将棉拭子放入1 mL运送培养基中密闭送检。

1.2.3检测方法 采用qRT-PCR法检测。所有采集的标本均在24 h内进行检测，检测前将标本置于微量振荡器上震荡1 min，充分混匀后，按照HBV核酸测定试剂盒(qRT-PCR法)及PCR扩增仪使用指导书规定的方法进行，测定1次即为结果。整个试验操作均严格按照操作规范进行，同时做内参、阴性和阳性对照，均在控。该试剂的线性检测范围为(1×102～1×108)IU/mL，最低检出限为20 IU/mL，若检测结果超出检测范围，予以复测并取平均值。

1.3统计学处理 利用Excel录入数据；采用SPSS21.0对数据进行分析。计量资料以均值表示，组间比较采用t检验或方差分析；计数资料采用百分数表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1采用不同采样液时HBV DNA检出情况 以运送培养基为采样液，两种浓度(5×106、5×104IU/mL)的标准品污染的载体表面HBV DNA阳性检出率均为100%，检测浓度的均值分别为6.81×103IU/mL和5.33×10 IU/mL；以生理盐水为采样液，两种浓度(5×106、5×104IU/mL)的标准品污染的载体表面HBV DNA阳性检出率均分别为100.0%和66.7%，检测浓度的均值分别为9.79×102IU/mL和1.86×10 IU/mL。以运送培养基为采样液的检出率均大于或等于以生理盐水为采样液者。见表1。

表1 以运送培养基和生理盐水为采样液时不同浓度的标准品污染的载体表面HBV DNA的检出情况

2.2不同浓度标准品污染的载体放置3、7 d的HBV DNA阳性检出率 4种浓度的标准品污染的载体各20份，其中10份放置3 d、10份放置7 d，检测载体表面HBV DNA浓度，样本合计80份。检测结果显示，HBV DNA总阳性检出率为93.8%(75/80)。所有载体放置3 d的总阳性检出率为92.5%(37/40)，放置7 d的总阳性检出率为95.0%(38/40)，阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 载体放置3、7 d后HBV DNA阳性检出情况

2.3不同浓度标准品污染的载体放置3、7 d的HBV DNA浓度比较 4种浓度的标准品污染的载体放置3 d后，载体表面检出的HBV DNA浓度均值分别为3.109×105、3.607×104、4.301×103、2.940×102IU/mL，差异有统计学意义(F=8.327，P<0.001)；放置7 d后，载体表面检出的HBV DNA浓度均值分别为2.874×105、2.450×104、1.554×103、1.683×102IU/mL，差异有统计学意义(F=7.302，P=0.001)。对4种浓度的标准品污染的载体放置3 d后HBV DNA浓度下降值与放置7 d后的下降值进行比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 载体放置3、7 d的HBV DNA浓度(IU/mL)

3 讨 论

病毒在环境表面的污染状况受到越来越多的专业人员及社会关注，特别是在病毒相关感染性疾病流行期间。我国《公共场所卫生指标与限值要求》中无环境表面卫生指标；《医院消毒卫生标准》中物体表面卫生标准中也无病毒检测要求及病毒检测方法；疾病预防控制中心等部门在对医疗机构、公共场所的日常检测中也未开展病毒检测。尹海等[6]、李存桂等[7]、陈美珍等[8]学者应用ELISA法对医疗机构环境表面行HBsAg检测，证实了环境表面存在HBV病毒污染，但不能证实是否存在传染的风险。检出HBV DNA是病毒复制和传染性的最可靠的指标，PCR技术检测病毒核酸对于评价病毒污染比ELISA法检测抗原、抗体更有意义，更能评估病毒传染的风险。

本研究用HBV标准品污染载体模拟环境表面，并探索性应用qRT-PCR法检测病毒DNA。qRT-PCR法与常规PCR法相比，其灵敏度更高，检测限可低至20 IU/mL。由于qRT-PCR法目前主要用于临床血清、体液标本的检测，本研究选用4种浓度标准品污染载体，最低浓度(5×103IU/mL)污染的载体放置7 d仍可检出HBV DNA，说明该检测方法用于环境表面标本等非人体标本检测具有一定可行性。

既往环境表面细菌学检测采样液多为生理盐水，因无环境表面病毒检测技术标准，本研究应用的病毒运送培养基是以氯化钠和葡萄糖为主要原料，通常用于对人体血清、体液等标本进行病毒检测，尚未用于环境表面；因此，本研究分别采用生理盐水及运送培养基作为采样液进行试验，结果显示，采样液为运送培养基时，载体表面HBV DNA的阳性检出率较高，因此可以选择运送培养基为环境表面HBV污染状况的采样液。此外，病毒运送培养基采样液为3～6 mL，经查阅文献，宋向阳等[9]对胃镜表面HBV污染状况进行采样时，选择1 mL的采样液，因此最终选用1 mL采样液，既保证了检测需求，又可提高检出率。

HBV感染者在医疗机构内进行手术、穿刺及各种治疗，极易将血液、体液喷溅、沾染到环境表面[10]，若未进行有效的清洁消毒处理，可能存在较长时间的污染，有一定的感染风险。有研究者报道，HBV可以在外部环境中存活7 d[11]，本研究结果显示，qRT-PCR法在放置3 d和7 d的HBV载体表面仍能检测出HBV DNA，充分证明了qRT-PCR法用于污染一定时间后的环境表面病毒核酸检测的可行性。新型冠状病毒肺炎疫情期间，疾病预防控制中心、部分医疗机构也尝试性地在部分医疗机构、公共场所进行了病毒核酸定性检测[12-13]，本研究采用qRT-PCR法定量检测污染载体的HBV DNA，该研究方法可应用于其他病毒污染的环境表面的检测，结果可为有关部门制订环境表面病毒检测技术标准提供参考依据。