薇甘菊叶斑病病原菌鉴定及寄主范围测定

林明辉, 曾伟, 柯沛强

茂名市林业科学研究所，广东 茂名 525000

薇甘菊（Mikania micrantha）为菊科藤本植物，通过攀缘并形成厚毯状枝叶层覆盖宿主植物，使宿主植物不能进行正常光合作用而衰亡。在2002 年被列入中国首批外来入侵物种名录，目前主要通过人工铲除和化学除草剂处理，成本高，效率低下，控制时间短，除草剂对宿主植物造成伤害且污染环境，控制效果差。

据国外报道，薇甘菊柄锈菌具有生防潜力[1]，国内有关引进柄锈菌利用文献报道不少，也取得了较好的效果，但未推广应用，且外来物种的入侵风险仍难以消除[2-4]，程伟文报道了豆荚大茎点霉对薇甘菊的生防潜力，但仍处于试验阶段[5]。

在薇甘菊为害区域调查发现，其叶片上有一种叶斑病，侵染叶片造成叶斑及叶枯，偶发侵染茎干造成枝枯，发生严重时，薇甘菊生长明显衰退，具备作为以菌防草研究的可能。本研究通过对薇甘菊叶斑病病原菌进行分离培养、纯化、致病性测定、病原鉴定、生物学特性和寄主范围测定的研究，旨在明确病原菌，探究病原菌培养特性及对本地主栽农作物、水果、经济作物安全性，从而为该菌的利用提供初步参考。

1 材料与方法

1.1 材料

薇甘菊病叶采自化州市良光镇长安村，薇甘菊覆盖桉树及橡胶林地边缘围园灌木，部分攀爬桉树及橡胶树，微甘菊新叶叶斑病发生率35%～65%，按常规方法对病害症状进行描述，并拍照。多点采集具备典型症状的叶片，保湿带回实验室，采样时间为2018 年4 月至5 月，晴天下午采样，共采样3次，每次采集叶片10 片。

1.2 菌株的分离及纯化

采用常规病原体分离法进行分离[6]，共分离50 皿150 个叶片组织块。对所分离出的真菌菌落采用琼脂平板稀释纯化法进行纯化[7]，并将纯化菌株转入试管斜面，保存于4 ℃冰箱内。

1.3 致病性测定

将1.2 纯化的菌株共7 株接到PDA 培养基上，置于自然光照培养室25 ℃±1 ℃培养2 d，在无病薇甘菊叶片中央采用无伤离体接种菌丝块，每片叶接种1 个直接0.4 cm 菌饼，并以接种无菌PDA 培养基为对照，参试菌株7 个，每个处理重复3 次，每个重复接种5 片叶片，保湿并室温培养，观察发病情况。若接种叶片发病则再分离，完成柯赫法则验证。

1.4 病原菌鉴定

1.4.1 形态鉴定

将病原菌（1.3 回接发病的菌株共1 个）接种于PDA 培养基上，置于自然光照培养室25 ℃±1 ℃培养3 d，观察病原菌菌落形态、产孢情况、产孢结构和孢子形态并测量拍照。

1.4.2 病原菌分子生物学鉴定

病原菌分子鉴定方法参照郑樊[8]。

1.5 温度对病原菌菌丝生长的影响

根据华南地区气温及病害发病规律，设置15、21、24、27、30、33、36 及42 ℃等8 个温度值进行菌丝生长试验。使用直径0.4 cm 菌饼接种，培养5 d 后用十字交叉法测定菌落直径，比较温度对病原菌菌丝生长的影响。

1.6 病原菌寄主范围测定

寄主范围测定以本地主栽农作物、水果和经济作物作为参试物，包括水稻、木薯、香蕉、龙眼、芒果、桉树、橡胶、甘蔗和桑树等。以菌丝段悬浮液喷雾无伤活体接种，将直径10 cm 培养皿长满菌丝的培养基取出，加水200 mL，使用料理机打碎，过滤，加水定容为500 mL，即得接种用菌丝段悬浮液，傍晚喷雾，每个参试作物接种3 次，每次喷雾5 个接种点，完全喷湿接种部位叶片表面，喷雾后5 d，观察记录发病情况，包括病斑形状、大小、颜色、深度和病征，如出现侵染，在接种后15 d，观察是否出现未喷雾叶片感染，即是否出现再侵染。

2 结果与分析

2.1 症状描述

薇甘菊叶斑病能入侵薇甘菊，使叶片、叶柄及未老化茎产生病变，初期为黄褐色点状病斑（见图1A），后逐渐扩大，近圆形或沿叶脉、侧脉扩展成不规则形病斑，病斑中央植物组织易失去水分而干枯、变薄、易裂、穿孔（见图1B 和C）。叶柄及枝条的病斑初期为褐色小点、略凹陷，后期不断扩大呈长条形褐色病斑，直至环绕枝条一圈。病叶保湿情况下，肉眼或用放大镜观察未见小黑点等其他病症。

2.2 病原菌致病性测定

分离纯化菌株回接只有1 个致病，其余菌株和对照不发病。接种后第3 天症状开始出现（见图2A），发病初期接种点呈黑色坏死，病健交界明显，随后病斑继续扩展，初期发病部位组织坏死分解（见图2B），将该菌菌落活体接种至薇甘菊无菌苗，表现为叶片及茎段发病，与田间观察到的症状相似（见图2C）。

2.3 病原菌形态

培养性状及形态在PDA 上菌落圆形，边缘未老熟菌丝白色，老熟后菌丝呈黄色，菌落整体颜色初期白色后变黄褐色至深褐色（见图3A）。在PDA上不产孢，将菌丝接种于薇甘菊无菌苗可产生分生孢子器和分生孢子。

图1 薇甘菊叶斑病症状Fig.1 Symptoms of Mikania micrantha leaf spot

图2 病原菌致病性测定Fig.2 Pathogenicity test of pathogenic bacteria

分生孢子器黑色、扁球形至球形（见图3 C 和D），直径60.2～185.3 μm×72.8～159.2 μm，分生孢子椭圆形到卵圆形，无色，单胞，顶端钝圆（见图3 B），分生孢子大小：3.9～7.1 μm×1.3～3.2 μm。

2.4 薇甘菊叶斑病病原系统发育分析

通过ⅠTS 对引物对菌株进行PCR 扩增、测序，得到长度分别为516 bp 的序列。将得到的序列在GenBank 中进行比对，并构建系统发育树，经MEGA7.0软件进行系统发育分析，系统发育树的各个分支的支持强度通过1 000 次重复的自展检验数值进行评估。结果发现，菌株（WGJ）与Boeremia exigua聚为一个进化枝（见图4），支持率为100%。依据形态鉴定和系统发育分析，叶斑病病原菌经鉴定为Boeremia exigua。

2.5 温度对菌丝生长的影响

试验结果看出，15～27 ℃范围内，该病原菌菌落直径随温度升高逐渐增大；27～42 ℃范围内，菌落直径随温度升高逐渐减小。菌丝生长适宜温度为24～33 ℃，最适温度27 ℃，42 ℃时菌丝不能生长，菌落直径与接入菌饼直径相同（见图5）。

2.6 病原菌寄主范围测定

经菌丝段悬浮液喷雾接种，除桑树出现少量病斑，其余参试作物均未出现被侵染症状（见表1）。

由表1 可知，所有参试作物，均未出现致死，仅桑树轻度发病，并未发现再侵染。

3 结论与讨论

经过对叶斑病的诊断和病原菌形态观察测定，包括分生孢子器形态，分生孢子形状、分生孢子大小，根据鉴定结果查阅相关资料[9]，初步鉴定薇甘菊叶斑病病原菌为Boeremia属真菌，依据形态鉴定和系统发育分析，叶斑病病原菌经鉴定为大豆茎点霉Boeremia exigua。病原菌菌丝生长适宜温度为24～33 ℃，最适温度27 ℃，与野外观测发生季节一致。

病原菌寄主范围测定显示可侵染桑树，韦海玲报道Boeremia exigua可致桑断枝烂叶病[10]，本研究接种未发现再侵染，具体原因有待进一步研究。王梦奇报道，Boeremia exigua可导致大豆茎点霉叶斑病[11]，但大豆非本地主要作物，未开展试验。本研究过程中在使用菌丝悬浮液喷洒薇甘菊过程中，薇甘菊宿主团花树（Neolamarckia cadamba(Roxb.)Bosser）出现叶斑症状，亦无再侵染现象发生。

图4 基于ⅠTS 序列构建ML 系统发育树Fig.4 Construction of ML phylogenetic tree based on ⅠTS sequences

图5 温度对菌丝生长的影响Fig.5 Effect of temperature on mycelia growth

谷祖敏报道草茎点霉(Phoma herbarum)具备作为生物除草剂防除鸭跖草的潜力，且生物安全性良好和环境安全性良好[12]。Marcinkowska J 认为，Boeremia exigua为多主寄生真菌，无寄主专化现象[13]。本研究对本地主要农作物等开展的寄主范围测定结果显示，大豆茎点霉寄主选择性较好，具备进一步开展生物除草剂研究的潜力。

表1 病原菌接种不同作物发病情况Tab.1 Host range determination of pathogenic bacteria