母牛安静发情鉴定技术概况及影响因素分析

周正义，田 莉，田宏志，李茹意，4，段晨莹，4，OBIANWUNA Uchechukwu Edna，吕丽华，王 栋*

(1. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193； 2. 山西农业大学动物科学学院，太谷 030801；3. 全国畜牧总站，北京 100125； 4. 吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118)

产犊后繁殖机能恢复的母牛，以及性成熟后繁殖机能正常的母牛，卵巢上会启动周而复始的卵泡发育、成熟与排卵等功能活动。伴随着卵泡逐渐发育与成熟，机体内雌激素水平逐渐升高，并作用于下丘脑及生殖器官，使母牛逐渐进入发情状态，表现出精神亢奋、环境兴奋性增加等精神征状，并伴随经常嗅闻其他母牛阴部、爬跨或被其他母牛爬跨、活动量增加、体温升高等行为与生理变化[1]。此外，由于雌激素浓度升高，母牛还出现生殖道上皮细胞增殖、血管增生并充血及阴部充血、红肿等炎症表现，使母牛产生不适感并频频排尿，阴道粘液分泌增加，且粘液逐渐稀薄透明[2-3]。但是，部分母牛虽然经历了正常卵泡发育与排卵变化，却不表现爬跨、活动量增加等明显的发情行为特征，这种现象被称为安静发情或隐性发情。安静发情很难被检出，常错失输精机会，导致产犊间隔延长，饲养成本增加。对10 493头高产奶牛发情表现统计分析显示，安静发情母牛占比达42.1%[4]，若高产奶牛推迟到产后85～115 d受孕，则每头延迟受孕牛每天的经济损耗约为2.48英镑(约22元人民币)[5]。因此，安静发情的检出是提高奶牛养殖效益的关键。人工观察发情费时费力，很难检出安静发情，也无法检出夜晚发情牛，发情检出率在50%～70%之间，差异较大[6]。随着技术进步，计步器逐渐应用于母牛发情监测，阴道温度也逐步应用于奶牛发情鉴定，发情检测逐步趋向于自动化、智能化，检测率逐渐提高[7-8]，为母牛安静发情检测技术研发带来新希望。然而，目前仍然没有一种成熟的自动化配套体系用于安静发情检测。另外，因为发情行为与雌激素、孕酮等有关，许多报道都将母牛安静发情归因为雌激素、孕酮等水平不足，安静发情内在机制尚不清楚。

本文综述了前人对安静发情的检测分析结果，希望通过母牛发情影响因素分析，推断安静发情发生的原因，以期为安静发情母牛的鉴定与新型自动化发情检测设备的研发提供数据支撑。

1 安静发情的鉴定分析

因为安静发情母牛没有爬跨、活动量增加等明显的发情行为，很难观察到其是否处于发情状态及何时进入发情状态。但安静发情母牛卵巢上同样能检测到卵泡的发育与排卵变化[4,9]，同时，发情母牛体内雌激素、黄体酮等生殖激素浓度也会随卵泡发育状态改变而发生相应变化[10]，发情牛体温、阴道粘液电阻值等同样会发生相应变化[8]，研究发现，黄体期母牛阴道粘液电阻值最高((49.7±9.0) Ω)，卵泡期开始下降，且当机体内促黄体素达峰值时电阻值最低((29.8±1.7) Ω)[11]。因此，可通过测定这些生殖激素浓度、体温、阴道粘液电阻值等变化，判断母牛卵泡发育状态及发情阶段，再观察其是否有细微的发情行为特征，确定该母牛是否发情，或是否属于安静发情。针对安静发情，生产中常用以下几种鉴定办法。

1.1 直肠触诊法与计步器或人工观察相结合

计步器可进行实时活动量检测，已成为奶牛发情鉴定的有效手段[12-13]。与基准活动量相比，发情母牛活动量会逐渐增加，但不同研究活动量差异较大，有的发情母牛活动量增加2～4倍，有的增加10多倍，活动量既有个体差异，也有时间段差异[8，14]。活动量较大的波动性，使计步器发情鉴定面临较大不确定性，安静发情作为发情牛活动量变化的极端表现，使计步器发情鉴定面临巨大挑战，并成为计步器发情鉴定的痛点。生产中常采用观察法或试情法佐证计步器发情鉴定，发情鉴定效果有所提升[15]，但这种基于发情行为的发情检测技术仍没有解决安静发情鉴定的问题。

直肠触诊是技术人员用手臂通过母牛直肠壁触摸卵巢形状、大小，感觉卵泡发育的一种传统方法。通过该方法得知卵泡发育情况后，再结合人工观察或计步器检测母牛行为变化，便可确定母牛是否属于安静发情[16]。研究表明，直肠触诊发情检测率可达90%以上[1，17]。但直肠触诊对工作人员经验、技术要求较高，触摸时应注意触摸位置并适当把控力度，否则会挤破卵泡，引起“手排”。此外，体型较小或过度肥胖的母牛会增加触诊难度，且检测时容易受技术员主观思想和作息时间影响，无法实现适时检测，难以实现夜间发情母牛检测。

1.2 超声诊断法与计步器或人工观察相结合

利用可发射B-型超声波的探头扫描直肠壁腹侧，根据超声波反射图像，可视化检测卵巢、卵泡结构的超声诊断法，能获得与直肠触诊一样的效果，当诊断到母牛卵泡发育成熟过程后，再结合人工观察或计步器，确定母牛是否发情或是否为安静发情[4，18]。超声诊断法出现于二十世纪七十年代[19]，在九十年代逐渐推广应用[20-21]。发情周期实际是卵泡募集、选择、优势化及排卵的周期性活动过程[22-24]，卵巢的形态、大小会随之发生相应变化[3]。成年母牛卵巢形状一般为扁卵圆形，成熟卵泡直径为12～19 mm，成熟黄体长径为20～25 mm[3]。邓立新等[25]利用B超图像分别准确记录了20头同期发情和超数排卵处理母奶牛卵巢、卵泡、黄体的形状、大小变化情况发现，同期发情母牛卵泡逐渐增大，到第5天达到最大，卵巢也持续增长，到第5天达到最大((41.0±0.6) mm)；而超数排卵母牛卵巢增长更大，直径达(49.2±0.7) mm。B超检测结果表明，牛群中安静发情占比很高(42.1%，4 417/10 493)， 是影响牛群繁殖性能的主要因素[4]。

与直肠触诊相比，超声诊断可准确、直观地观察到母牛卵泡发育情况。并且，超声仪逐渐趋于便携化，使用也越来越便捷，超声诊断法简单易学，不仅可观察卵巢组织结构进行发情鉴定，还可用于母牛妊娠诊断[26-27]。然而，超声诊断仍未克服实时检测发情问题，同样无法检出夜晚发情母牛。而且，除了便捷性外，牛场还要考虑人力及仪器成本、用后保养、维修等问题。

1.3 孕酮检测法与计步器或人工观察相结合

上述两种方法都通过观察卵泡形态、大小变化判断母牛是否发情，而孕酮检测法则通过检测卵泡发育过程中孕酮浓度变化，判断母牛发情与否及其状态。孕酮是孕激素的主要成分，在母牛发情周期中呈现规律性变化，并表现出不同的生理作用。黄体期母牛孕酮浓度较高，可促进下丘脑表达雌二醇受体，增加下丘脑的雌激素敏感性[28-29]。随着黄体逐渐退化，母牛体内孕酮浓度逐渐降低，卵泡发育抑制逐渐解除，卵泡迅速发育，雌激素分泌量逐渐升高，中枢神经在少量孕酮协同作用下接受雌激素刺激使母牛表现出发情行为。卵泡发育成熟至排卵前后，卵泡颗粒细胞开始黄体化并逐渐形成黄体，雌激素分泌逐渐降低，母牛发情行为逐渐减退。然而，也有研究表明，孕酮分泌量逐步增加，达到一定浓度后，通过中枢负反馈调节作用于下丘脑，抑制GnRH分泌，使雌激素分泌量降低，动物发情行为逐步消失[3]。研究发现，黄体期母牛孕酮浓度基本为2～10 ng·mL-1，卵泡期母牛孕酮浓度<1 ng·mL-1[8]。因此，母牛发情过程常伴随孕酮逐步下降而雌二醇逐步升高现象[8]。同样，安静发情母牛卵泡发育、成熟、排卵过程也伴随孕酮浓度变化，因此，生产中可使用孕酮检测结合计步器方法进行发情鉴定，当发现母牛体内孕酮含量逐渐减少，而计步器未检出活动量明显增加，便可确定该母牛为安静发情。据此，Ranasinghe等[30]检出母牛产后第1、2、3、4次排卵发生安静发情的概率分别为55.2%、23.8%、21.3%和10.5%。

传统孕酮检测使用酶免疫分析法(enzymeimmunoassay，EIA)与放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)[31-32]分析牛血液或乳汁中孕酮浓度，需反复采集、处理血液或乳汁样品，操作较繁琐，但孕酮测定可验证各种发情检测方法的准确性[8]。随着科技进步，一种用于孕酮检测的生物传感器被研发[33]，可直接在挤奶厅完成检测，不需奶样脱脂，检测时间更短。然而，尚未见到针对孕酮24 h实时检测的报道，准确、自动识别发情母牛，自动检测将是未来孕酮检测的发展方向。

1.4 乳温检测法与计步器或人工观察相结合

通过安装在挤奶装置上的乳温自动测量传感器在挤奶时收集乳温数据，根据乳温变化，进行母牛发情鉴定。二十世纪七八十年代，乳温指标就已被用于发情检测，并得到72%～84%的发情检测率[16，34-35]。但是，这些发情检测结果多来源于发情行为正常母牛，检测安静发情的研究很少。1988年，Fordham等[35]发现，某些安静发情牛发情时乳温升高。1997年，Gil等[16]发现，安静发情牛乳温平均升高0.6 ℃，推测可通过乳温检测鉴定安静发情。

与上述3种方法相比，乳温检测可实现发情鉴定自动化、智能化，大大减少了人力需求，乳温与其他发情检测方法结合，还可识别急性乳腺炎或其他发烧症状等疾病母牛。但该方法只能在挤奶时收集数据，如果发情持续时间较短，且刚好发生在两次挤奶间隔，将导致母牛发情检测失败，打破挤奶时间及频次制约是乳温检测的关键。乳温检测还受乳温升高对发情指示规律判定的影响。研究表明，以乳温升高0.3 ℃作为判定母牛发情标准，发情检测率为50%，以0.6 ℃为标准，发情检测率为32%[36]，Gil等[16]以乳温最低升高0.4 ℃作为发情判断标准，检测出了78.9%的安静发情母牛。此外，乳温受乳流速、环境温度、测量距离等因素影响[37]，乳流速慢、环境温度低、测量距离远都会影响乳温检测准确性。要研发乳温发情监测系统，必须准确区别发情牛与炎症母牛，并建立适时、精准的自动化乳温检测技术。

1.5 阴道温度检测与计步器或人工观察相结合

母牛发情会伴随体温变化，但传统直肠温度检测很难高频次、持续监测母牛体温[38]，于是有研究比较分析了母牛各部位温度检测效果，发现阴道温度与体温相关最大[39]，可通过温度自动检测装置持续、精准地收集母牛阴道温度，并根据阴道温度变化自动进行母牛发情鉴定。Walton和 King[40]认为，母牛发情时体温升高是因为活动量增加所导致，然而有研究表明，母牛发情体温升高与体内激素分泌相关，其中，与促黄体素激增有关[41]；或者可能由内源性和外源性孕酮增加引起[42]。Suthar等[42]研究发现，妊娠母牛阴道温度比未妊娠牛高(0.3±0.01)℃，血清孕酮浓度高(5.5±0.4)ng·mL-1；在9头经产泌乳牛排卵2 d后，使用孕酮处理48 h(阴道埋植controlled internal drug-releasing, CIDR装置)后，再移除装置，发现孕酮处理期间阴道温度高于处理前、后(分别高(0.2±0.05) ℃，(0.1±0.05)℃)，但是，血清孕酮浓度与体温之间并不存在相关性[42]。本团队研究表明，母牛发情开始前阴道温度逐渐升高，发情结束前4 h，温度逐渐下降[8]。发情时阴道温度升高0.4 ℃以上[1，41，43]，但很遗憾，这些报道没有研究发情母牛雌激素和孕酮浓度变化，母牛发情时体温升高的机制仍有待研究。但是，阴道温度变化结合活动量变化，有可能实现安静发情母牛发情检测。

与乳温检测相比，阴道温度检测受气温、湿度等环境因素影响小[15]，且可持续、实时收集数据[8]，检测发情更为可行。与孕酮检测、直肠触诊和超声诊断相比，阴道温度实现了自动化、智能化发情鉴定。但阴道温度检测要求更严格、精确，以避免引起母牛阴道感染。

1.6 尿液、粪便、唾液检测与计步器或人工观察相结合

母牛发情时会吸引一些未发情母牛嗅闻其阴户，可能是因为发情母牛体内激素变化引起了尿液、粪便甚至其他体液化学成分改变，从而产生某些特殊挥发性化合物吸引牛群嗅闻发情母牛阴户、尿液等[44-45]，并表现出一些兴奋性。研究表明，发情母马尿液中含有对甲酚信息素，会引起公马阴茎勃起[46-47]；公猪颌下腺可分泌5α-雄酮、3α-雄酮信息素进入唾液，该类信息素可刺激并延长母猪发情行为[48]。同样，发情母牛也可产生某些信息素，通过空气传播吸引公牛，甚至可对其他母牛产生神经刺激。为此，可通过特殊仪器，分析发情母牛尿液、粪便、唾液样品中这类特殊化合物的成分和含量，并探讨其发情周期的变化规律，以指导母牛发情鉴定。对奶牛不同发情时期粪便样品的气相色谱-质谱分析表明，有10种表现时间特点的挥发性化合物，其中，乙酸、丙酸和1-碘十一烷仅存在于发情期；丁酸、2-丙烯酯、羧酸和戊酸仅存在于发情前期；3-己醇、丁烷、膦酸等仅存在于发情后期[45]；对奶牛排卵前、排卵和排卵后尿液的气相色谱-质谱分析表明，邻苯二甲酸二丙酯和1-碘十一烷两种化合物仅存在于排卵期，而在排卵前、后两个时期均未检测到[44]。而对尿液促黄体素的ELISA检测发现，摩拉水牛发情期尿液促黄体素显著增加，发情前期为(59.08±3.28)mIU·mL-1，后期为(63.74±3.41)mIU·mL-1，两者差异不显著，但发情期显著增加，达到(73.74±4.11)mIU·mL-1[49]。对水牛唾液促黄体素的检测发现，发情前期促黄体素浓度为(20.53±0.60)mIU·mL-1，发情期显著增加，达到(32.44±1.03)mIU·mL-1，而后缓慢下降，到发情后期达到(15.77±0.49)mIU·mL-1[50]。发情母牛粪便、尿液和唾液中都含有发情标志物分子，这为发情鉴定技术研发提供了新思路。

犬的鼻子是天然气味检测器，常接受气味检测训练，进行爆炸物、毒品等搜索。目前有研究指出，犬经特殊诱导训练后，可从试验样品中辨别出发情期尿液(准确率最高达80.3%)和唾液(平均准确率为57.6%)样品[51-52]，所以，可对犬进行相关训练，以进行发情鉴定，但目前还未见直接用犬进行发情检测的报道，可能犬进行发情检测，会使母牛产生应激反应，不利于生产，且犬发情鉴定的训练方法及效果也会影响鉴定准确率[51]，如能模仿犬嗅觉系统，根据母牛粪便、尿液、唾液等的信息素变化规律，研发出电子鼻，或许会解决应激和不稳定性问题。然而，目前还没有关于安静发情牛尿液、粪便等信息素变化规律研究的报道。

综上所述，尿液、粪便及唾液发情检测，虽然不能实现数据的适时、自动收集，但相对超声检测、直肠触诊及阴道温度检测来说，却实现了无创检测，可大大降低检测引起的母牛应激。发情期间尿液、粪便等特殊生物信息素及唾液促黄体素的存在，为将来开发经济高效的生物传感器，研发新型母牛安静发情检测体系打开了新思路。

2 影响母牛安静发情的因素分析

凡是能抑制母牛发情表达的因素都会增加母牛安静发情概率。对产奶量、营养因素、牛只种类以及环境条件等母牛发情影响因素的分析，将为解决安静发情鉴定问题提供理论指导，并提高母牛发情检出率。

2.1 产奶量

高产奶牛泌乳早期产奶量上升很快，但是，该阶段母牛干物质采食量较低，导致体能供不应求，母牛因消耗自身体脂供能产奶，出现能量负平衡，使雌二醇等类固醇化合物分解代谢增强，浓度下降，对下丘脑刺激减弱，引起安静发情。高产奶牛发情当天血清雌二醇浓度显著低于同期低产奶牛，且产奶量每增加1 kg，发情活动量减少1.6%[8]。此外，牛场为保障高产奶牛产奶，持续饲喂高营养水平饲料，增加了高产奶牛肝血流量，加快了类固醇化合物的肝代谢速度，降低了雌二醇的血液浓度[53]，使母牛发情表现减弱，甚至表现为安静发情。

以上研究表明，高产奶牛容易发生安静发情，可能是其体内雌二醇分解代谢快，降低了其循环浓度，减少了对下丘脑的刺激，使发情强度降低，甚至表现安静发情。生产上，或许可通过静脉注射外源雌激素如环戊丙酸雌二醇[54]或控制高产奶牛饲料营养水平，降低安静发情发生概率。

2.2 营养

营养因素可通过影响雌激素、孕酮等与发情行为相关激素的合成与分泌，通过下丘脑-垂体-性腺轴，影响母牛发情行为，导致安静发情[3，55-57]；或通过影响机体健康导致安静发情。因此，对母牛进行营养调控，确保营养充足及品质优良尤为重要。

研究表明，营养不足会抑制下丘脑促性腺激素释放激素的分泌，减少垂体性腺激素的产生[55，58]，Whisnant等[59]发现，低营养水平使产后母牛血清促黄体素浓度显著低于高营养水平母牛((0.5±0.03) ng·mL-1< (0.9±0.03) ng·mL-1，P<0.01)。营养不足影响了下丘脑-垂体-性腺轴的调控功能，使卵泡发育受阻，发情行为随之减少。同时，蛋白质、维生素等营养水平不足会导致机体内孕酮合成原料不足，使黄体分泌孕酮减少，降低了下丘脑的孕酮刺激程度，使雌激素受体数量减少，降低了下丘脑的雌激素敏感性，使发情表达降低，甚至表现安静发情[3,28，56]。此外，微量元素是动物机体酶、激素等化合物的组成成分，缺乏时将导致物质代谢紊乱，机体病变[60]，从而减弱发情表现，甚至发生安静发情。例如，钙、磷缺乏使母牛牙齿松动、采食量降低、精神萎靡、卧地不起[61]；铜缺乏使奶牛骨骼疏松，骨骼、关节变形，运动失调[62]；锰缺乏使母牛卵巢萎缩、排卵延迟，严重时表现为卵巢静止和不发情。卵巢静止母牛血浆锰浓度((1.25±0.20) mmol·L-1)显著低于正常母牛((1.31±0.82) mmol·L-1)，且卵巢静止母牛血液雌激素浓度((46.09±3.76) ng·L-1)也显著低于正常母牛((82.35±5.89)ng·L-1)[63]。然而，营养水平过高，奶牛过度肥胖，易造成卵巢、输卵管脂肪堆积，影响卵泡发育，减弱发情表达[3]。研究表明，雌激素及其受体不但具有生殖调控作用，还参与了机体能量调控，人体脂肪组织含有雌激素受体(estrogen receptor, ER)，成熟脂肪细胞可表达ERmRNA[64-65]；下丘脑弓状核、视旁核及腹内侧核等也可表达ER[64]。肥胖母牛过多的能量调控需求，减少了循环雌激素浓度，降低了对下丘脑发情调控中枢的刺激强度，使母牛发情表达减弱，甚至引起安静发情。另外，腐败变质的饲料含有黄曲霉素、镰刀菌毒素等大量霉菌毒素，可引起母牛中毒，表现出食欲降低、消化不良、腹泻、流产等病理状态[66]，发情行为也随之减少。

2.3 产后带犊

除营养、产奶量等因素外，产后带犊也会导致母牛安静发情。幼犊吮乳以及挤奶机器刺激母牛乳头，反馈作用于下丘脑，导致催乳素(prolactin，PRL)分泌增加，抑制母牛发情[3]。此外，母牛去除卵巢后，一定浓度外源雌激素也可使其发情，但在此之前经高浓度雌激素预处理后，再给予其正常浓度雌激素，去卵巢母牛则变得难以发情[67]。这可能是高浓度雌激素提高了下丘脑反应阈值，降低了对正常浓度雌激素刺激的敏感性，导致母牛发情行为减弱。母牛产后第一次排卵与这种情况相似，妊娠末期为胎儿降生做准备，母牛分泌大量雌激素，以刺激产道收缩，并促进乳腺腺泡和导管系统发育[3,68]，这种高浓度雌激素提高了下丘脑的反应阈值，使母牛下丘脑降低了对产后第一次发情时雌激素的敏感性，导致母牛发情行为减弱，甚至发生安静发情[67]。研究表明，产后首次发情，安静发情概率为50%～90%[30,67]，第二次发情呈安静发情的概率为6%～50%[30]，说明随时间推移，下丘脑对雌激素的敏感性逐渐恢复，发情行为也逐渐增强，安静发情发生概率则逐步降低。

因此，生产中多关注高产奶牛、营养不良母牛及产后带犊母牛发情情况，做好饲料营养调控、人工代喂牛犊等，可以提高母牛发情表达，降低安静发情概率。

2.4 环境条件

高温高湿环境下，牛食欲显著降低，导致营养摄入不足，减少雌二醇产生，影响发情表达[69]，更易发生安静发情。且较长时间高温环境会减少母牛发情行为[70-71]。研究表明，夏季母牛发情活动量增加倍数(5.58±2.94)显著低于春、秋、冬季增加倍数(6.84±4.12、6.49±4.12、8.10±4.64，P<0.05)[8]。因此，牛场做好夏季防暑降温，有助于减少安静发情现象。

养殖地表类型可影响母牛发情爬跨活动[55]。与混凝土地面相比，泥土地面饲养的奶牛发情爬跨频率更高，说明泥土地面更有利于牛只活动。此外，泥土的热传导比混凝土慢，能增加牛舒适感，有利于其表现发情行为。因此，设计养殖场地面时，应考虑地表摩擦力及舒适度，以提高母牛发情表达能力，降低安静发情率。

此外，种群密度、种群等级、是否有公畜等群体环境都会影响发情表达[55]。适当增加种群密度会显著提高母牛爬跨活动[55]，但密度过高，活动范围受阻，也会降低母牛发情活动。同时，体型大的母牛通常会阻止弱小母牛的发情活动[55]。因此，应科学进行牛群分配及调栏工作，降低安静发情发生概率。此外，公畜对提高母畜发情表达意义重大。例如，公猪唾液中5α-雄酮、3α-雄酮信息素会延长母猪发情行为[48]；公羊可通过特有体态、叫声及其散发的特有信息素，提高母羊促黄体素分泌，提升母羊雌激素水平，增加其发情表达[55，72]。同样，公牛介入也可提高母牛发情表达，防止安静发情发生。

3 结 语

母牛安静发情一直困扰着养牛业，虽然其具有正常卵泡发育、成熟及排卵过程，但无明显发情行为，关于其发情规律研究还未见报道，现有发情监测方法也难以检出安静发情牛，这给养牛业造成了巨大损失。研究表明，产奶量、营养、环境都可导致母牛安静发情。虽然可通过科学管理、合理营养、改善环境尽量避免安静发情的发生，然而，深入进行母牛发情规律研究，寻找粪便、尿液、乳汁等非侵入性发情母牛生物标记，以及体温、阴道粘液电阻值等生理性发情标记，进行其发情周期规律研究，并结合物联网、生物信息等技术，研发更精准、高效的发情鉴定技术，将有可能彻底解决母牛安静发情鉴定的问题。