十六份辣椒材料游离氨基酸组成的主成分分析与聚类分析

张 婷，刘慧琴，郭勤卫，李朝森，章心惠，项小敏，赵东风，万红建

(1.衢州市农业林业科学研究院，浙江 衢州 324000； 2.浙江省农业科学院 蔬菜研究所， 浙江 杭州 310021)

辣椒是一种重要的辛香蔬菜作物，富含辣椒素、维生素等营养成分，具有重要的食用价值。除食用外，还可以进行精深加工提取辣椒素和辣椒红色素，是重要的工业原料[1]。目前辣椒的品质研究主要集中在加工品质和鲜食品质两个方面。辣椒加工品质的研究内容主要集中在加工过程中辣椒素[2-4]、总糖[5]、干物质[6]、氨基酸[7]等营养成分的含量变化，和不同辣椒品种加工品质的差异[8]，并建立了高辣椒素、高红色素深加工专用型辣椒品种评价标准[9]。而辣椒鲜食品质的研究大多集中在维生素C、辣椒素、可溶性蛋白含量等成分的测定和分析上，研究发现，辣椒果实中维生素C的含量在成熟过程中呈逐渐增加的趋势，转色期至红熟期含量达到最高[10]。常晓轲等[11]对64份辣椒种质资源中辣椒素的含量进行鉴定评价，发现不同类型的辣椒辣度等级都集中在6、7、8和9这4个级别，其中朝天椒的辣度普遍高于其他品种；王蜜蜜等[12]通过测定26份辣椒组合中的辣度、VC、可溶性糖和可溶性蛋白质的含量，筛选获得营养品质较好的2号辣椒组合；付文婷等[13]以贵州的10个地方辣椒品种为材料，对辣椒果实的干物质、维生素C、粗纤维、粗脂肪、辣椒素和蛋白质共6种营养成分含量进行测定和分析，并利用隶属函数法对其营养品质指标进行综合评价，发现综合品质最优的品种为‘福泉线椒’。但至今国内还未见对辣椒品质研究中游离氨基酸种类和含量的研究报道，因此，对游离氨基酸种类、含量等品质指标开展研究，对提高辣椒种质资源开发利用具有重要意义。

氨基酸作为蛋白质的分解产物是评价食品质量及营养价值的重要指标，游离氨基酸又称非蛋白氨基酸，可被人体直接吸收，其含量成分是评价食物营养的关键指标[14]，也是影响食物风味的重要因素，氨基酸可呈现出鲜、甜、酸、苦及涩等味感，从而形成了食物不同的风味[15]。到目前为止，蔬菜中已有食用菌、黄花菜、茭白、鲜食玉米等游离氨基酸种类及含量分析研究的报道，研究发现，食用菌风味贡献最大的是甘氨酸[16]，黄花菜中风味贡献最大的是谷氨酸[17]，茭白风味形成贡献最大的是天冬氨酸和谷氨酸[18]，鲜食玉米中甜味氨基酸和鲜味氨基酸占比较大，其中甜玉米中风味形成贡献最大的是丙氨酸和谷氨酸[19]。水果中梨[20]、猕猴桃[21]、橄榄[22]等也有相关研究，发现不同的水果中游离氨基酸种类和含量差异明显。因此，分析研究辣椒中游离氨基酸的组成种类和含量对辣椒食用品质鉴定具有十分重要的意义，尤其是对一些苦味较淡、鲜味较明显的白辣椒品种。

主成分分析(principal component analysis，PCA)目前已被广泛应用于农产品品质评价特征性指标筛选和品质综合评价。刘伟等[17]分析不同黄花菜品种游离氨基酸综合质量的差异，通过PCA综合评价黄花菜的品质，获得品质较好的品种；侯娜等[23]对13个不同产地花椒种质的氨基酸进行分析，并通过系统聚类分析把多个花椒种质归为3类，简化品质评价工作；王馨雨等[24]测定不同百合品种的游离氨基酸的含量，基于PCA获得品质较好的3个百合品种。本研究通过分析不同辣椒材料的游离氨基酸含量，采用PCA和聚类分析法对游离氨基酸品质指标进行分析和综合评价，明确不同品种辣椒游离氨基酸的组成和含量差异性，获得辣椒游离氨基酸品质评价的关键指标，建立游离氨基酸综合品质评价模型，为辣椒营养与特征风味、品种筛选，以及产品的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试16份辣椒材料由衢州市农业林业科学研究院提供，涉及羊角椒、螺丝椒、线椒和泡椒等类型，具体编号见表1。试验所取样品为开花后35 d的新鲜果实，于2019年5—7月采收，根据色泽和外形，选择成熟度均一的商品果进行试验。所有样品采摘后用保鲜袋分装，再放入加有冰块的泡沫纸箱，取回放-80 ℃冰箱保存待用。

表1 十六份辣椒材料特性

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

采用10%的三氯乙酸水解法预处理样品，辣椒去柄去籽进行匀浆，匀浆后称取3 g置于离心管中，加入10%(质量分数)三氯乙酸溶液30 mL冷藏过夜，8 000 r·min-1离心5 min。取上清液过0.22 μm水系微孔滤膜上机待测。每个样品3组平行，测定结果取平均值。

1.2.2 氨基酸自动分析条件

游离氨基酸的测定采用日立(Hitachi)L-8900全自动氨基酸分析仪。试验方法参照刘伟等[17]，并用系统自带软件进行初步数据整理。

1.3 数据分析

采用SPSS 19.0软件对数据进行相关性分析、主成分分析和聚类分析。相关系数可以反映各游离氨基酸含量之间的线性相关程度。主成分分析是从中提取能够包含大部分信息的主成分，并利用各主成分得分(Fi，i=1，2，3，…)和相应权重相乘后求和得到综合评价函数来进行综合评价。采用系统聚类法对16份辣椒材料进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 不同辣椒游离氨基酸的组成与含量

由表2可知，16份辣椒材料中分别含有16～17种氨基酸，其中包括7种必需氨基酸，1种条件必需氨基酸酪氨酸(Tyr)，组氨酸(His)和精氨酸(Arg)2种营养半必需氨基酸，以及7种非必需氨基酸。从表2可以看出，不同辣椒材料中游离氨基酸的含量差异明显，但种类差异并不明显，除了D7和L1不含有脯氨酸外，其余14份材料中均含有17种氨基酸。

不同辣椒材料之间的游离氨基酸总量、人体必需氨基酸、呈味氨基酸和限制氨基酸的含量均存在较大差异。从总氨基酸含量来看，游离氨基酸变化范围为10.57～25.68 mg·g-1。其中D1中游离氨基酸总量最高，可达25.68 mg·g-1，D2和D4含量相近，均高于20 mg·g-1；含量最低的是L1。从必需氨基酸含量来看，变化范围为7.64～19.24 mg·g-1，其中含量最高的为D1，其必需氨基酸含量占游离氨基酸总量的74.95%，含量最低的为L8，仅占68.23%。16份辣椒材料中呈味游离氨基酸总量以D4含量最高，为6.80 mg·g-1，占游离氨基酸总量的29.22%；D3最低，只有2.45 mg·g-1；而对于限制游离氨基酸含量而言，最高的是D1，为0.64 mg·g-1，占游离氨基酸总量的2.48%，L1最低，只有0.15 mg·g-1。在检测到的17种氨基酸中，各种氨基酸按含量高低排序，Thr最高，其次为Asp、Glu、Ser，最后为Cys、Met、Tyr、Pro。Thr在16份材料中含量最高，平均值为10.21 mg·g-1；Pro含量最低，平均值为2.1 mg·g-1。

2.2 呈味氨基酸特征分析

鲜食辣椒食用时口感丰富，不同的辣椒风味不同。大部分青辣椒清苦，白辣椒味鲜，柿椒微甜，这些风味均与其所含的丰富游离氨基酸有关。Glu是主要的鲜味氨基酸，白辣椒味鲜可能谷氨酸含量较高。依据氨基酸的呈味特征，大致可将其分为苦味氨基酸(Arg、Val、Met、Ile、Leu)、鲜味氨基酸(Asp、Glu、Lys)、甜味氨基酸(Ser、Thr、His、Pro、Gly、Ala)、芳香族氨基酸(Cys、Tyr、Phe)。

由表3可知，不同辣椒材料中味觉氨基酸含量高低依次为：甜味氨基酸>鲜味氨基酸>苦味氨基酸>芳香族氨基酸。甜味氨基酸含量变化范围为0.66～1.90 mg·g-1，平均值为1.11 mg·g-1，其中D2含量最高，占味觉氨基酸的77.55%；鲜味氨基酸含量变化范围为0.18～0.49 mg·g-1，平均值为0.29 mg·g-1，占味觉氨基酸总量的19.33%，D4是含量最高的材料，达到0.49 mg·g-1，占味觉氨基酸含量的21.03%。芳香族氨基酸含量变化范围为0.02～0.05 mg·g-1，D1芳香族氨基酸含量最高，达0.05 mg·g-1，占味觉氨基酸的2.06%；苦味氨基酸含量变化范围为0.04～0.17 mg·g-1，D1含量最高，达0.17 mg·g-1，占味觉氨基酸总量的6.61%。不同辣椒材料的呈味氨基酸组成模式图轮廓相似(图1)，贡献最大的是甜味氨基酸，其次为鲜味氨基酸。可看出D1的模式图面积最大，说明在D1中4种味觉氨基酸含量普遍高于其他辣椒材料。

图1 不同辣椒的呈味氨基酸组成模式图Fig.1 Comparative profiles of taste-active amino acids in different cultivars of peppers

表3 不同辣椒材料呈味氨基酸含量

2.3 不同辣椒材料游离氨基酸相关性分析

对16份辣椒材料的17种氨基酸成分进行相关性分析，结果如表4所示，各氨基酸指标之间有正相关也有负相关，且多数相关系数的绝对值大于0.5，表明各游离氨基酸品质指标间具有较强相关性。Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Cys、Val等氨基酸之间相关性达到较高水平。Glu与Asp、Thr、Ser、Gly、Cys、Val、Ile、Lys、His、Arg存在极显著(P<0.01)正相关，与Ala、Met和Leu呈显著(P<0.05)正相关；Asp与Ser、Glu、Gly、Ala、Val、Ile、Leu、Lys及Arg呈极显著(P<0.01)正相关，与Thr、Cys、His呈显著(P<0.05)正相关；Pro与其他氨基酸均不存在显著相关性(P≥0.05)。Leu与Ile呈极显著(P<0.01)正向关，相关系数为0.947，是所有相关系数中最高的。

2.4 不同辣椒材料的游离氨基酸的主成分分析

由表5可知，由于前3个主成分对应特征值均大于1，累计方差贡献率为83.50%，故可选取前3个主成分。3个相互独立的综合性变量，反映不同辣椒材料游离氨基酸的大部分信息。

因子载荷值(表6)反映辣椒各氨基酸指标对主成分载荷的相对大小和影响的方向，数值反映原变量对因子影响的大小，正负代表变化方向的差别。由表5、6可知，第1主成分中载荷较高的氨基酸指标有Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Cys、Val、Leu、Phe、Arg、Lys、His、Ile、Ala、Met和Tyr含量，载荷值均为正相关，其中Gly、Cys、Val、Lys、Ile和His含量的载荷值均大于0.9，说明当第一主成分越大时，其包含的这些氨基酸含量就越高。第1主成分公因子的方差贡献率最大，为64.92%，表明第1主成分对辣椒游离氨基酸品质的影响最大。第2主成分中Ala含量载荷较高且有正向影响，载荷值为0.659，第2主成分方差贡献率为10.49%；第3主成分中Pro含量的载荷值较大且有正向影响，载荷值为0.653，第3主成分方差贡献率为8.09%。

表4 游离氨基酸指标间相关性分析

2.5 不同辣椒材料游离氨基酸的综合评价

从表5可知，当提取3个主成分时可解释的累计方差达到83.50%，因此选用前3个主成分已经足够描述游离氨基酸的总体水平。以17个游离氨基酸指标为初始自变量(依次编为X1～X17)，经标准化后再进行PCA，最终得出3个主成分因子的方程系数如表6所示，其方程式表达式如下：

表5 总方差分解结果

F1=0.225X1+0.243X2+0.25X3+…+0.276X15+0.258X16+0.035X17；

F2=0.264X1-0.081X2+0.269X3+…-0.061X15+0.219X16+0.403X17；

F3=-0.161X1-0.208X2-0.134X3+…-0.112X15+0.021X16+0.557X17。

这3个主成分因子将原来17个初始指标做正交变换组合成一组新的、彼此无相关性的综合指标，基本涵盖氨基酸指标的大部分信息。

3个主成分从不同方面反映出不同辣椒材料中游离氨基酸的总体水平，单个主成分并不能对不同辣椒材料中游离氨基酸的质量作出综合评价，因此以每个主成分对应方差的相对贡献率作为权重，对3个主成分得分进行加权求和，由评价函数(F=0.775F1+0.126F2+0.096 9F3)计算各辣椒材料的综合评分，总得分高低反映辣椒游离氨基酸综合质量的高低。由表7可知，第1、2、3主成分得分最高的分别是D1、D4和L8，最低的分别是L3、D1和D2。各品种辣椒综合品质从高至低的排序如表7所示，16个辣椒材料中D4的综合值最高为5.655，并且显著高于其他辣椒材料，说明D4游离氨基酸综合质量最高，D3的综合值最低为-2.577，其综合质量较低。根据排名可知，综合值大于0的辣椒材料有6份，其中有3份地方品种(D1、D2和D4)，3份高代自交系(L7、L5和L8)。剩余10份材料的综合分为负分，说明这些材料的游离氨基酸品种低于平均水平。

表6 主成分载荷矩阵及系数

2.6 聚类分析

将辣椒材料的17个游离氨基酸指标含量作为变量，采用SPSS19软件对16份辣椒材料的游离氨基酸进行系统聚类分析，区间选择欧式距离，聚类方法选择Ward法，数据进行标准化。聚类结果如图2所示，16份辣椒材料可分成3类，L3、L9、L2、D3、L6、L1、L4为第Ⅰ类，必需氨基酸含量相对较低；D5、D6、D7、L5、L8和L7为第Ⅱ类，游离氨基酸总量较高，品质相对较好；D1、D2和D4为第Ⅲ类，谷氨酸和天冬氨酸氨等呈味氨基酸总量高，营养品质好；该聚类结果与之前的PCA分析结果相比，得到的分析结果大体一致，除了个别材料差异较明显，该差异的形成可能是受到种植区域环境(土壤、气温)和栽培技术等因素的影响。

表7 不同辣椒材料的成分得分和综合得分

3 讨论与结论

随着生活水平的提高，人们越来越关注营养品质和食味品质，而辣椒品质育种的基础是种质资源。辣椒种质资源繁多，不同类型的辣椒所含的营养成分差异较大。为更好地开发利用不同辣椒材料游离氨基酸品质特性，尤其是一些适应性强、抗性强和品质优的地方品种，本研究就此开展不同辣椒材料游离氨基酸营养品质分析和综合评价。研究结果表明，16份辣椒材料游离氨基酸含量丰富，含有16～17种氨基酸，总量为10.57～25.68 mg·g-1，高于已报道的花椒[23](0.387～2.701 mg·g-1)和芡实[25](0.98 mg·g-1)游离氨基酸含量，与玉米[19](8.79～23.86 mg·g-1)、黄花菜[17](10.47～17.24 mg·g-1)等农产品中总氨基酸的含量相当。且不同辣椒材料之间氨基酸总量、人体必需氨基酸、呈味氨基酸及限制氨基酸的含量均存在较大差异，与其他蔬菜作物中的研究结果一致。D1中游离氨基酸、必需氨基酸及限制氨基酸的含量均最高，D4的呈味氨基酸含量最高。不同辣椒材料中味觉氨基酸含量从高到低为甜味氨基酸>鲜味氨基酸>苦味氨基酸>芳香味氨基酸。这一结果与其他蔬菜作物中结果不一致，因为不同的蔬菜作物其游离氨基酸种类和含量不同，所体现出风味是不一致的，如黄花菜中鲜味明显，其呈味氨基酸中鲜味氨基酸明显高于其他3种。

图2 不同辣椒材料的聚类分析图Fig.2 Dendrogram from cluster analysis of different peppers

主成分分析能够反映原始变量的大部分信息，且所含信息互不重复，具有更优越的性能。本文通过PCA从17种游离氨基酸中提取到3个主成分，其累计方差贡献率为83.50%，较好地反映辣椒游离氨基酸品质的综合信息。根据表6可看出，17个指标在3个主成分上的载荷，其中有15个指标在F1上的载荷最高，并且载荷均为正。说明F1主要体现了辣椒游离氨基酸品质的差异，可称为氨基酸品质因子。在F2上，载荷绝对值最高的指标只有Ala，且在F2上D4的得分最高，D1的得分最低，说明F2主要体现不同辣椒材料中甜味氨基酸的含量差异，可称为甜味氨基酸因子。在F3上，载荷绝对值最高的为Pro，Pro在逆境条件下会大量积累，可作为植物抗逆性鉴定的生理指标。在F3得分上则表现为L8最高、D2最低，且7个地方品种中除D1外均为负值，由此推测F3可能与不同辣椒的抗逆性关系较大，地方品种大多为多年自然条件下选育的，抗逆性较强，因此F3可称为抗逆性因子。

经过分析建立综合评价模型：F=0.775F1+0.126F2+0.096 9F3，计算得到不同辣椒材料游离氨基酸综合评价得分，得分越高表示该品种游离氨基酸的综合质量越好。16个品种得分从高到低分别为D4、D1、D2、L7、L5、L8、D6、D7、L4、L2、D5、L9、L6、L1、L3、D3，能较为准确地评价16个辣椒材料游离氨基酸综合质量，排名靠前的材料D4、D1、D2可用于后续的育种当中。采用聚类分析将16份辣椒材料可分为3类，该聚类结果与之前的PCA相比，得到大体一致的分析结果，较好地反映辣椒不同种质间的差异性，但是也有个别品种结果不一致，此差异可能受到种植区域环境(土壤、气温)和栽培技术等因素的影响。两者均能较好地反映出辣椒不同种质间的差异性。因此，采用聚类分析对辣椒的游离氨基酸品质进行分类是可行的，该试验可为地方特色辣椒品种的引种推广、开发利用，及氨基酸营养价值评价提供良好参考。