亚致死浓度的吡虫啉对萼花臂尾轮虫种群动态的影响

葛乐乐， 白 琰， 孙 帆， 江 姗， 席贻龙

(1.安徽师范大学 生态与环境学院，安徽 芜湖 241002;2.皖江流域退化生态系统的恢复与重建省部共建协同创新中心，安徽 芜湖 241002)

新烟碱类杀虫剂是于20世纪90年代初被引入市场的一类重要杀虫剂，具有广谱、高效、低毒、害虫不易产生抗性等优点[1]。吡虫啉是世界上使用最广泛的一种新烟碱类杀虫剂，已在120个国家注册并用于140多种作物的害虫防治[2]。吡虫啉的作用机理是通过摄食或直接接触作用于靶物种，阻断其乙酰胆碱受体神经元通路，使其产生突触的持续性兴奋，最终使靶物种瘫痪或者死亡[3-4]。由于对哺乳动物具有低毒性，吡虫啉还被用于宠物或者伴侣动物体表跳蚤的有效控制[3]。然而，由于其在土壤中的持久性(半衰期为48～190天)、高溶解度(514mg/L，20℃)和低辛醇水分配系数(Log Kow=0.57)，吡虫啉可以通过漂移、溶解径流或浸出而成为地表和地下水的潜在污染物[5]。随着吡虫啉广泛的使用，其在越来越多的水体中被检出。在日本东京Sagami湖中检测到的吡虫啉含量为0.104μg/L[6]，在加拿大安大略省湖泊中检测到的最大浓度为972ng/L[7]，在希腊色雷斯湖泊中检测到的最大含量为102ng/L[8]；在我国广州珠江检测到的最大浓度为154ng/L[9]，在长江扬州支流的最高浓度为1886ng/L[10]。水体中残留的吡虫啉会对线虫(Caenorhabditiselegans)[11]、节肢动物[12-15]、斑马鱼[16]等产生毒性作用，影响生物群落结构[17-19]，最终可能通过食物链影响人类健康[20]。因此，全面评估吡虫啉等农用化学品对水生生物的生态风险具有重要的意义。

作为藻类等的消费者以及鱼类等幼体的食物，轮虫在水生食物链中具有重要的作用。因此，吡虫啉等污染物对轮虫存活、生殖和种群增长等的影响势必会影响水生态系统的结构和功能。然而，目前有关吡虫啉对轮虫的毒性作用尚鲜有报道。本研究采用种群增长、休眠卵产量和生命表实验等方法研究了不同浓度的吡虫啉对萼花臂尾轮虫种群增长参数和生命表统计学参数的影响，旨在了解吡虫啉对萼花臂尾轮虫存活、生殖和种群增长的影响，同时比较各参数对吡虫啉污染的敏感性。

1 材料与方法

1.1 轮虫的采集和培养

萼花臂尾轮虫由采自芜湖市龙窝湖水体沉积物中的休眠卵孵化而得，实验室内在(24±1)℃、无光照的培养箱中进行克隆培养。以EPA[21]作为培养液，用HB-4培养液[22]培养的斜生栅藻作为食物。当斜生栅藻种群处在指数增长期时，先离心收集，然后在光学显微镜进行计数。实验前对轮虫种群进行一周以上的预培养，预培养期间轮虫的喂食密度在1.5×106个细胞/mL，种群始终被维持在指数增长期。

1.2 吡虫啉浓度的设置和测试液的配制

实验用吡虫啉原药(分子式C9H10ClN5O2，晶体状，纯度为99.1%)购于北京勤诚亦信科技开发有限公司，4℃下避光、干燥保存。

测试液浓度按等比间距设为7个梯度，分别是1.56、3.12、6.25、12.5、25、50和100mg/L，另设一个空白对照组。利用EPA培养液预先配制好100mg/L的母液，然后逐步稀释得到所需浓度的测试液。母液于4℃冰箱中避光保存，3d更换一次。

1.3 3-d种群增长和4-d休眠卵产量实验

实验参照Xi和Feng的方法[23]进行。以龄长在4h以内的轮虫幼体作为受试动物，实验条件与预培养时相同。实验前，由预培养的轮虫种群中挑出20只轮虫幼体置于容积为12mL的玻璃试管中，然后向试管中加入相应浓度的测试液10mL(内含1.5×106个细胞/mL的斜生栅藻)。每组设置3个重复。实验过程中，每12h悬浮一次沉积在试管底部的斜生栅藻，每24h将试管内的萼花臂尾轮虫移至干净试管中，并加入新鲜配制的测试液和所需数量的斜生栅藻，同时计数试管底部的轮虫休眠卵。3d后，抽样计数各试管中带卵的非混交雌体和混交雌体数以及不带卵的雌体数。待全部计数完成后，将所存活的个体放入试管中继续培养24h，24h后记录试管底部和轮虫身体末端所带的休眠卵数。

基于上述计数结果，按照Xi和Feng的方法[23]，计算或统计种群增长率、种群混交率和休眠卵产量：

种群增长率r=(lnNt-lnN0)/t，其中，Nt为3天后的种群密度，N0为实验开始时的种群密度(2只/mL)，t=3d；

种群混交率=种群中带卵的混交雌体数目/种群中各类雌体总数；

休眠卵产量=种群在10mL培养体积中于4d内所产的休眠卵总数。

1.4 生命表实验

实验在8mL玻璃烧杯中进行，每杯中加入相应浓度的测试液5mL(内含1.5×106个细胞/mL的斜生栅藻)和龄长在4h以内的萼花臂尾轮虫幼体10只，每组设置3个重复，实验条件与种群增长实验相同。实验过程中，每12h观察并记录每个烧杯里存活的轮虫母体数和孵化出的幼体数，去除死亡母体，将孵化出的幼体转移到干净的烧杯里继续培养，根据其所产的卵的类型确定雌体类型，由此计算出轮虫母体所产全部后代中混交雌体所占的比例(后代混交率PS)。每24h将存活的母体转移至含有新鲜测试液和藻类食物的烧杯中。实验至母体全部死亡时结束。

根据实验过程中记录的相关数据，按照朱韩等[24]的方法，计算出特定年龄存活率(lx)和繁殖率(mx)、净生殖率(R0)、生命期望(e0)、世代时间(T)和种群内禀增长率(rm)等生命表统计学参数。

1.5 数据处理

采用SPSS 19.0和Excel 2003软件对种群增长和生命表统计学等参数进行统计学分析。用生存分析中的Kaplan-Meier模型分析各处理组和对照组之间轮虫同生群存活时间的差异显著性。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和多重比较(LSD检验)分析吡虫啉浓度对各参数影响的显著性以及各浓度处理组与对照组之间的差异显著性；通过回归分析方法分析轮虫各种群增长参数和生命表统计学参数与吡虫啉浓度间的关系[24]。

2 结果与分析

2.1 吡虫啉浓度对轮虫种群增长参数的影响

单因素方差分析显示，吡虫啉浓度对轮虫种群增长率有显著性影响(P<0.01)，但对种群混交率和休眠卵产量无显著性影响(P>0.05)。多重比较显示，与对照组相比，12.5mg/L吡虫啉处理组中轮虫种群增长率显著升高(P<0.05)，而50和100mg/L吡虫啉处理组中轮虫种群增长率则显著降低(P<0.05)(表1)。回归分析结果表明，吡虫啉浓度与轮虫种群增长率之间呈现出显著的剂量-效应关系，两者之间的关系可以描述为y=1.511×10-6x2-0.003x+0.69(R2=0.481,P<0.01)。

表1 暴露于不同浓度吡虫啉溶液中萼花臂尾轮虫的种群参数(均数±标准误差)

2.2 吡虫啉浓度对轮虫生命表统计学参数的影响

暴露于各浓度吡虫啉溶液中的轮虫存活率和繁殖率如图1所示。存活分析结果表明，吡虫啉浓度对轮虫存活率和繁殖率峰值均有显著性影响(P<0.05)。和对照组相比，100mg/L吡虫啉处理组中轮虫的存活率和繁殖率峰值均显著降低。

图1 暴露于不同浓度吡虫啉溶液中萼花臂尾轮虫的存活率和繁殖率

单因素方差分析显示，吡虫啉浓度对轮虫存活(以生命期望为指标)、发育(世代时间)、生殖(净生殖率)和种群增长(内禀增长率)等参数均有显著性影响(P<0.01)，但对后代混交率无显著性影响(P=0.135)。多重比较表明，与对照组相比，3.12～12.5mg/L吡虫啉处理组中轮虫的生命期望显著延长(P<0.05)，而25～100mg/L吡虫啉处理组中轮虫的生命期望则显著缩短(P<0.01)。1.56～12.5mg/L吡虫啉处理组中轮虫的世代时间显著延长(P<0.05)，而50～100mg/L吡虫啉处理组中轮虫的世代时间则显著缩短(P<0.01)。1.56～12.5mg/L吡虫啉处理组中轮虫的净生殖率显著升高(P<0.01)，而25～100mg/L吡虫啉处理组中则相反(P<0.01)。50～100mg/L吡虫啉处理组中种群内禀增长率显著降低(P<0.05)(表2)。

表2 暴露于不同浓度吡虫啉溶液中萼花臂尾轮虫的生活史参数(均数±标准误差)

回归分析结果显示，在本实验设置的吡虫啉浓度范围内，吡虫啉浓度与轮虫的存活、发育、生殖和种群增长等参数之间均具有显著的剂量-效应关系(P<0.01)(表3)。

表3 萼花臂尾轮虫的生命期望、世代时间、净生殖率和内禀增长率与吡虫啉浓度(mg/L)间的关系

3 讨论

3.1 吡虫啉对水生生物的急性毒性

已有研究表明，吡虫啉对斑马鱼幼体的LC50值为143.7mg/L[16]，对大型溞的24h LC50值为118.9mg/L，对鲤鱼(Cyprinuscarpio)幼体的24h LC50为208.3mg/L，对日本沼虾(Macrobrachiumnipponensis)成虾的24h LC50为0.089mg/L[25]，对泽蛙(Ranalimnocharis)蝌蚪的24h LC50为177.3mg/L[26]，对介形纲(Cypridopsisvidua和Ilyocyprisdentifera)的24h LC50分别为0.542和0.759mg/L[13]。本研究中，在最大溶解范围内(510mg/L)吡虫啉并未对萼花臂尾轮虫造成50%以上的死亡率，因此我们估计吡虫啉对轮虫的毒性较低。究其原因可能在于轮虫神经系统进化程度低，对神经性药物的敏感性相对较差[27]。

3.2 杀虫剂对轮虫种群增长率、种群混交率和休眠卵产量等参数的影响

种群增长实验是以轮虫为受试生物进行生态毒理学研究的常用方法，实验研究的种群增长率、种群混交率和休眠卵产量等参数是监测污染物对轮虫孤雌生殖和有性生殖影响的常用指标[28,29]。已有研究表明，总体上，较高浓度的杀虫剂使轮虫种群增长率、种群混交率和休眠卵产量显著降低。如浓度高于0.4、0.1和0.05mg/L的甲基托布津(thiophanate-methyl)分别使萼花臂尾轮虫的种群增长率、种群混交率和休眠卵产量显著降低[23]，浓度高于0.64mg/L的DDT、0.8和1.2mg/L的三氯杀螨醇(dicofol)、7.0mg/L的硫丹(endosulfan)和14.0mg/L的林丹(lindane)使萼花臂尾轮虫的种群增长率显著降低，浓度高于0.16mg/L的DDT、0.025mg/L的三氯杀螨醇、0.875mg/L的硫丹和14.0mg/L的林丹使萼花臂尾轮虫的种群混交率显著降低[30]，浓度高于1.62和0.54mg/L的西维因(Carbaryl)分别使萼花臂尾轮虫的种群混交率和种群增长率显著降低[31]。与上述研究结果不同，本研究发现较高浓度(50和100mg/L)的吡虫啉也使萼花臂尾轮虫的种群增长率显著降低，但较低浓度(12.5mg/L)的吡虫啉使种群增长率显著升高，此外，吡虫啉浓度对轮虫种群混交率和休眠卵产量无显著性影响。这些结果之间存在的差异可能与杀虫剂的种类以及所设置的浓度范围有关。

3.3 杀虫剂对轮虫生活史参数的影响

之前有报道显示，较高浓度的杀虫剂对存活、生殖和种群增长具有抑制作用，而较低浓度的杀虫剂则起促进作用，抑制作用和促进作用的显著性有时因杀虫剂种类的不同而存在差异。如较高浓度的西维因、甲基对硫磷(methylparathion)、林丹、二氯苯胺(3,4-dichloroaniline)、杀螟硫磷(fenitrothion)、毒死蜱(chlorpyrifos)、DDT和三氯杀螨醇等杀虫剂使萼花臂尾轮虫的生命期望显著缩短，净生殖率和种群內禀增长率显著降低[32-37]，较低浓度的艾氏剂(aldrin)使轮虫的生命期望显著延长，净生殖率和种群內禀增长率显著升高[38]。然而，较低浓度的十氯丹(chlordecone)使萼花臂尾轮虫的净生殖率升高，但对生命期望和种群內禀增长率无显著性影响[39]。本研究中，较高浓度的吡虫啉对萼花臂尾轮虫的存活、生殖和种群增长具有显著的抑制作用，较低浓度的吡虫啉对轮虫的存活和生殖具有显著的促进作用，但对种群增长无显著性影响。

低浓度的杀虫剂等污染物对轮虫存活、生殖或种群增长的促进作用通常被归因于其“毒物兴奋效应(hormesis)”[40]，而较高浓度的抑制作用被认为是其毒性作用所致。

3.4 轮虫各种群参数和生活史参数对杀虫剂的敏感性

以轮虫为受试生物开展的短期慢性毒性测试中，种群增长率和种群混交率对大多数杀虫剂均是敏感的指标[23,30，31,41-43]。在现在的研究中，种群增长率对吡虫啉污染敏感，但种群混交率却不敏感。

轮虫各生活史参数对杀虫剂的敏感性也常因杀虫剂种类的不同而存在着差异[32-39]。本研究发现，在监测较低浓度的吡虫啉对萼花臂尾轮虫存活、发育和生殖的促进作用时，世代时间和净生殖率是较敏感的指标，而在监测较高浓度的吡虫啉对轮虫存活、发育和生殖的抑制作用时，生命期望和净生殖率是较敏感的指标。

在研究环境胁迫条件下轮虫实验种群变动过程中，生命表实验和种群增长实验是互为补充的两种方法，两者的结合有利于揭示轮虫种群动态的过程和机理[44]。已有研究表明，种群增长实验得出的种群增长率不仅在数值上低于生命表实验得出的种群內禀增长率，而且在对食物密度和污染物浓度等变化的敏感性方面也存在着差异[44，45]。本研究结果表明，种群增长率在数值上低于种群內禀增长率，但在对较高浓度吡虫啉的抑制作用的敏感性方面与种群內禀增长率相同，在对较低浓度吡虫啉的促进作用的敏感性方面高于种群內禀增长率。