木贼定居对铅锌尾矿砂微生物多样性及重金属迁移转化的影响

刘建华 宋凤鸣 袁小康 刘登彪 肖鹏发 曾伟民

（1. 湖南高岭环保科技有限公司，湖南长沙 410153；2. 中南大学资源加工与生物工程学院，湖南长沙 410083）

1 引言

采矿产生的尾砂通常残留大量的重金属并以多种形态存在，尾砂库养分含量低、保水能力差，在没有客土等辅助措施时，人工造林容易出现成活率低、植物易退化等现象［1］，已成为尾矿区生态修复的重要难题。尾矿地存在少量重金属耐受和富集植物，这些植物及根际微生物越来越多地被研究和应用在尾矿生态修复中。张崇邦、陈友静、杨静丹等［2-5］研究得出五节芒定居可显著提高尾矿砂微生物群落多样性、土壤微生物生物量、呼吸速率及酶活性，提高了结合态重金属的含量，降低了阳离子交换态和残渣态重金属含量。吴照祥等［6］利用高通量测序研究了胡枝子复垦对江西省德兴铜矿1 号尾砂库微生物的影响，胡枝子复垦改变了土壤细菌群落结构、功能组成以及微生物多样性，显著提升了信号传导和细胞通信等功能基因丰度。

木贼（Equisetum hyemale L.）是典型的重金属耐受性和指示植物，同时也是铅锌尾矿废弃地自然恢复过程中常见的先锋植物［7］。本文通过对铅锌尾矿区尾矿裸地和木贼定居自然恢复地土壤微生物群落进行研究，并分析木贼定居对尾矿土壤成分和微生物多样性的影响，以期为尾矿区生态修复提供理论参考。

2 材料与方法

2.1 研究区概况

实验尾砂库位于湖南省郴州柿竹园柴山尾砂库（113°09′E，25°47′N），靠近东河。该地区属于中亚热带季风性湿润气候，年降水量一般为125～1 700 mm，无霜期长，较利于植物生长。

2.2 土壤取样

分别在尾矿裸地和木贼定居自然恢复区域随机选择多个1 m×1 m 样方，用直径为4 cm 的土钻按五点取样法采集0～20 cm 土层，用无菌袋带回实验室，用灭菌工具去除土样中的植物和动物残体等杂质，将2 种土样的多个样品混合成1 个样品置于无菌离心管中，尾矿裸地土壤样品命名为szy1，植被恢复尾矿地样品命名为szy2。采样后隔天即取少量土样进行DNA 提取，以减小环境变化对微生物群落的影响。另一部分土样风干、磨细过100 目筛和1 mm筛，用于测定土壤理化性质。

2.3 分子生物学实验

参考相关文献［8-10］的方法，对2.2 土样进行基因组DNA 抽提和PCR 扩增。真菌采用通用引物ITS1F/ITS2R（5′-CGTAGGTGAACCT-GCGGAAGGATC-3′），（5′-GTTCAGCGGGT-GATCCTGCCTG-3′）扩增，细菌采用通用引物515F/907R（515F：5′-GTGCCAGCM GCCGCGG-3′；907R：5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）扩增。扩增产物的测序委托上海凌恩生物科技有限公司完成。

2.4 理化性质测定

参考相关文献［11］，对2.2 中风干过筛土壤进行有机质、全N、全P、全K、全Pb、全Zn、全Cu、全Cd、DTPA-Pb、DTPA-Cd 含量测定。

2.5 数据处理及分析

基于Qiime 平台，采用RDP classifier 贝叶斯算法，对97%相似水平的OTU 代表序列进行分类学分析，并分别在各分类水平统计各样本的群落组成。细菌比对采用Silva 数据库，真菌比对使用Unite 数据库，置信度阈值为0.7。

采用SPSS 软件数据进行处理和分析。

3 实验结果与分析

3.1 尾矿库尾砂基本理化性质

实验尾矿库尾砂基本理化性质见表1。尾砂有机质、全N、全P 整体均处于较低含量水平，木贼群落根际土壤有机质、全N 含量显著高于无植被尾矿裸地，尾矿裸地全Pb、全Zn、全Cu、全Cd、DTPA-Pb、DTPA-Cd 均显著高于木贼群落根际土壤。重金属指标中Pb，Cd，DTPA-Pb，DTPA-Cd 含量均超过《土壤环境质量标准》（GB 15618—1995）三级标准（保障农林生产和植物正常生长的土壤临界值），其余指标均符合三级标准。

表1 实验尾矿库尾砂基本理化性质

3.2 不同类型尾矿地土壤真菌多样性

3.2.1 不同类型尾矿地土壤真菌多样性指数分析

2 个样本分别获得38 761，40 952 个真菌序列。对多样性指数进行分析，见表2。OTU 分布显示，木贼根际土壤样品szy2 获得325 个真菌OTU，而无植物尾矿砂样品szy1 仅获得70 个OTU，其中共有OTU 为35 个。ace，Chao 指数与OTU 基本一致。尾矿裸地样本szy1 的真菌shannon 指数较szy2 小，simpson 指数相对较高，因此尾矿裸地真菌多样性相对较低。

表2 样本真菌多样性

3.2.2 不同类型尾矿地土壤真菌序列分析

从门的多样性来看，子囊菌、未明确分类真菌和担子菌是铅锌尾矿地土壤的优势真菌。样本真菌ITS序列分析见表3。Fungi-Unclassified 在2 个样本中分别占9.84%，11.10%。子囊菌门（Ascomycota）在尾矿裸地和植被恢复尾矿地的土壤真菌中的丰度较接近，分别为79.81%，79.29%。其中，szy1 子囊菌门主要集中在散囊菌纲、座囊菌纲，丰度分别为38.65%，32.84%，而szy2 子囊菌门主要集中在粪壳菌纲（55.10%）。担子菌门（Basidiomycota）则在样本szy1 丰度较大（8.05%），szy1 担子菌门集中在银耳纲（Tremellomycetes，3.90%），szy2 担子菌门集中在伞菌纲（Agaricomycetes，4.92%）。未明确分类真菌（Fungi-Unclassified）在样本szy2 丰度（11.10%）大于szy1（9.84%），接合菌门（Zygomycota）在szy2 中丰度较大（3.55%），主要为Mortierellomycotina。球囊菌门（Glomeromycota）主要为共生丛枝菌根真菌，仅出现在样本szy2 中，丰度为0.12%。

表3 样本真菌ITS 序列分析

从科属的多样性来看，样本szy1 的真菌主要分布在26 个科47 个属，样本szy2 的真菌分布在92 个科179 个属。2 个样本的属水平多样性分析见图1。2 个样本丰度大于1%的属各有14 个，其中曲霉属（Aspergillus）、侧孢霉属（Calcarisporiella）、被孢霉属（Mortierella）为2 个样本中共有的优势属，Ascomycota-Unclassified，Lasiodiplodia，Meripilus，Arthrobotrys，Trichoderma，Didymella，Paramyrothecium仅存在于szy2 样本。Alternaria（29.14%），Amorp hotheca（27.71%），Aspergillus（7.93%）为样本szy1 中主要优势真菌，Fusarium（33.53%）、Chaetomiaceae-Unclassified（11.40%）、Calcarisporiella（6.74%）为 样本szy2 中主要优势真菌。

图1 微生物群落

木贼定居对尾矿砂真菌属水平分布影响较大。样本szy1 中丰度大于1%的优势属如Alternaria，Amorphotheca，Fungi-Unclassified，Aspergillus，Guehomyces，Serendipita，Gibellulopsis，Trichocomaceae-Unclassified，Penicillium，Cladosporium，Curvularia，Pleosporales-Unclassified 等在szy2 中丰度均显著下 降， 而 Fusarium，Chaetomiaceae -Unclassified，Fungi-Unclassified， Calcarisporiella，Ascomycota-Unclassified，Mortierella，Lasiodiplodia，Meripilus，Nectriaceae -Unclassified，Arthrobotrys，Trichoderma，Didymella，Paramyrothecium 等在样本szy2 中丰度显著升高。样本szy2 中球囊菌门丛枝菌根真菌主要为内养囊霉属（Entrophospora），丰度为0.11%。

3.3 不同类型尾矿地土壤细菌多样性

3.3.1 不同类型尾矿地土壤细菌多样性指数分析

细菌的OTU 分布显示，2 个样本获得556，989个OTU，其中共有OTU 为464 个。在覆盖率大于97%的情况下，样本szy2 的OTU 数、shannon 指数高于样本szy1。simpson 指数低于样本szy1，表明样本szy2 细菌多样性相对较高，见表4。

表4 样本细菌多样性

3.3.2 不同类型尾矿地土壤细菌序列分析

从门的多样性来看，样本szy1 细菌分布于23个门，样本szy2 分布于25 个门。除Nitrospinae，Bacteria-norank 仅分布于szy2 外，其他门在2 个样本中均有分布。变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）是研究区土壤中的优势细菌类群，在2 个样本中合计均占60%以上丰度。样本细菌16S rDNA 序列分析见表5。Gammaproteobacteria 在szy1 中丰度高于szy2，而Alphaproteobacteria，Betaproteobacteria，Deltaproteobacteria 在szy2 中丰度较高。厚壁菌中Bacilli 在szy1 中丰度较大，Clostridia 在szy2 中丰度较大。厚壁菌门（23.93%）、浮霉状菌门（3.29%）、硝化螺旋菌门（1.97%）、疣微菌门（1.23%）、广古菌门（1.43%）等在样本szy1 中的优势菌属在szy2 中丰度下降，而样本szy2 中绿弯菌门（7.55%）、拟杆菌门（7.49%）、放线菌门（7.32%）、芽单胞菌门（5.71%）、酸杆菌门（4.11%）菌属丰度较szy1 有大幅升高。

表5 样本细菌16S rDNA 序列分析

从科属的多样性来看，样本szy1 的细菌主要分布于152 个科、308 个属；样本szy2 的细菌主要分布于164 个科、318 个属。2 个样本的属相对丰度分布见图2。样本szy1，szy2 分别有25，27个丰度大于1%的优势属，除Bellilinea（2.77%）仅分布在样本szy2 外，其他属在2 个样本中均有分布。共有优势属包括Lactococcus，Bacillus，Gemmatimonas，Sulfuricaulis，Dongia，Sulfurifustis，Azoarcus，Nitrospira，Burkholderia，Acidobacterium，Acidithiobacillus，Pelobacter，Holophaga 等。szy1 中丰度大于5%的优势属包括Lactococcus（10.93%）、Sulfuricaulis（7.69%）、Bacillus（6.83%）、Serratia（5.44%），而szy2 中丰度大于5%的优势属仅有Gemmatimonas（5.70%）。可见样本szy1 中菌属的丰度比例相对集中，样本szy2 细菌的属水平分布相对均衡，样本szy2 细菌多样性相对较高。

图2 细菌群落

木贼定居对细菌属水平分布影响较大，如样本szy1 和szy2 中优势硫细菌属分别为Sulfuricaulis（7.69%）和Sulfurifustis（3.64%）。Lactococcus，Sulfuricaulis，Bacillus，Serratia，Dongia，Methylobacillus，Planctomyces，Nitrospira，Burkholderia，Xanthomonas，Solirubrobacter，Skermanella，Acidithiobacillus，Holophaga，Methanobacterium，Streptococcus，Sporomusa，Pseudomonas，Ohtaekwangia 等 在 样 本szy1 中 丰度大于1%的优势属在样本szy2 中丰度显著降 低， 而Gemmatimonas，Sulfurifustis，Azoarcus，Pelobacter，Bellilinea，Acidobacterium，Sphingomonas，Chitinophaga，Massilia，Sphingobacterium，Sacchariba -cillus， Anaeromyxobacter， Chloroflexus， Stella，Bdellovibrio，Steroidobacter，Geobacter，Cytophaga 在样本szy2 中丰度升高。

3.4 微生物多样性影响因素分析

从Pearson 相关性分析结果来看，pH 与真菌和细菌ace，shannon 指数无显著相关性，见表6。有机质、全N 与真菌和细菌ace，shannon 指数在0.01水平显著相关。全Zn、全Cu、全Cd、DTPA-Pb、DTPA-Cd 与真菌和细菌ace，shannon 指数在0.01水平显著相关，且相关系数均为负值；全Pb 与真菌shannon 指数和细菌Chao 在0.01 水平显著负相关，与真菌Chao、细菌shannon 指数在0.05 水平显著相关。

表6 微生物多样性指数与土壤成分相关性分析

4 讨论

木贼定居对尾矿砂真菌群落结构影响较大，显著提高了真菌多样性。木贼根际土壤中散囊菌纲、座囊菌纲丰度较尾矿裸地下降，而粪壳菌纲丰度增加，故木贼定居导致土壤中植物病原菌丰度上升。但粪壳菌纲中Fusarium 等优势真菌同时也是木质素和纤维素降解菌，故这些优势真菌对植物枯落物的分解同时也有利于土壤有机质含量增 加。Alternaria，Aspergillus，Fusarium，Mortierella，Penicillium，Cladosporium 等尾矿砂优势真菌均为重金属耐性真菌，与多数研究结论［12-14］一致。Amorphotheca，Calcarisporiella，Chaetomiaceae-Unclassified等虽尚未有研究证明为重金属耐性真菌，但其能适应超标铅镉离子胁迫环境，表明对铅镉存在一定耐受性。

木贼定居同样提高了尾矿砂细菌多样性，但Lactococcus，Bacillus，Gemmatimonas，Sulfuricaulis，Dongia，Sulfurifustis，Azoarcus，Nitrospira 等仍是尾矿地优势细菌，表明这些菌群对铅、镉有一定耐性，与研究结论［15-17］一致。样本优势菌中均存在硫氧化菌（Sulfur-Oxidizing Prokaryotes，SOP），这类细菌可通过生物氧化与产酸作用将难溶性的重金属从固相溶出而成为可溶性的金属离子［18］，导致重金属DTPA提取态含量上升。Sulfuricaulis，Sulfurifustis 等SOP在2个样本中分别占9.34%，5.00%，Thiobacillus，Thiobacters 等各占1.45%，1.43%，与木贼定植区域重金属DTPA 值更低的实际情况一致。异化金属还原菌（Dissimilatory Metal Reduction Bacteria，DMRB）和参与脱硫反应的硫酸盐还原菌（Sulfate-Reducing Prokaryotes，SRP）可有效固化尾矿重金属［18-19］，Geobacter，Pelobacter，Anaeromyxobacter 等DMRB 丰度 在 szy2 中 增 大，Desulfobulbus，Desulfofrigus，Desulfuromonas 等SRP 在szy2 中的总丰度（0.437%）高于szy1（0.396%），与木贼定植区域重金属总量更低的实际情况一致。

细菌多样性变化还反映出木贼定居对土壤氮循环的显著影响。固氮弧菌Azoarcus 在样本szy1 中丰度为1.82%，在szy2 中的丰度增加至3.03%。而Bradyrhizobium，Rhizobium，Azorhizobium，Mesorhizobium 等主要根瘤菌属总丰度则从样本szy1 的0.38%升高至样本szy2 中的1.51%。硝化细菌Nitrospira 则反之，丰度从样本szy1 中1.96%降低至szy2 中1.08%。具反硝化能力的Lactococcus，Serratia，Methylobacillus，Planctomyces，Pseudomonas 等［20］szy1 的优势细菌同样在szy2 中丰度显著降低，表明木贼定居尾矿促进了固氮微生物繁殖、抑制硝化和反硝化作用，有利于生物固氮和降低土壤氮素损失。

木贼作为先锋植物能在尾矿定居并逐渐扩大种群，主要依靠孢子传播和分蘖进行繁衍，而重金属离子对多数蕨类孢子萌发及配子体发育有不良影响［21-22］，故Entrophospora，Azoarcus 等植物共生菌可能在木贼定植前期孢子萌发、配子体发育和幼苗耐受污染中起作用。许多根际微生物均可进入植物体成为内生菌，谢霞研究了Bacillus，Sphingomonas，Staphylococcus 属多株龙葵内生菌对铜锌的生物淋洗效应［23］，验证了内生菌与根际菌有着相同的重金属修复机制。木贼植株内是否存在与根际细菌类似的内生菌，是否对木贼对重金属的强耐受性以及囤积重金属有影响，尚有待进一步研究。

环境因子与微生物多样性相关性分析显示，有机质、全N 与微生物数量及多样性显著相关，重金属含量与微生物数量及多样性显著或极显著负相关，与多数研究结论一致［24-25］，表明有机质和全N 含量与微生物数量及多样性可相互促进和协同发展，高重金属含量会对微生物数量和多样性产生抑制，同时微生物多样性的增长有利于重金属含量降低。故在尾矿生态修复实践中，应对尾矿砂进行改良，补充有机质和氮素营养，提高土壤微生物数量和多样性，也可引入重金属钝化功能微生物菌剂，接种丛枝菌根真菌、共生固氮菌等，降低胁迫和提高植物对重金属的耐受性。同时，人工植被恢复中可多引入木贼等乡土草本先锋植物，推行草本先行、灌草结合和人工修复与自然演替相结合的恢复模式。

5 结论

（1）子囊菌、未明确分类真菌和担子菌是铅锌尾矿地土壤的优势真菌。木贼定居导致散囊菌纲、座囊菌纲丰度下降，粪壳菌纲丰度增加。Alternaria，Amorphotheca，Aspergillus 为尾矿裸地中主要优势真菌，Fusarium，Chaetomiaceae-Unclassified，Calcarisporiella 为木贼根际土壤主要优势真菌。

（2）木贼定居改变了尾矿砂细菌群落结构和功能多样性。变形菌门、厚壁菌门、放线菌门是研究区土壤中的优势细菌类群，Lactococcus，Bacillus，Gemmatimonas，Sulfuricaulis，Dongia，Sulfurifustis，Azoarcus，Nitrospira 等是尾矿地优势细菌。

（3）有机质、全N 与真菌和细菌ace，shannon 指数显著相关，重金属含量与真菌和细菌ace，shannon指数显著或极显著负相关。木贼定居提高了尾矿砂中微生物的种类和多样性，有利于有机质和氮素营养成分的积累和降低重金属含量；同时木贼根部可富集吸收土壤中游离态重金属离子，木贼群落自然恢复发挥了较好的植物-微生物协同修复效应。在尾矿生态修复实践中可引入木贼等乡土草本先锋植物，同时补充有机质和氮素营养，或引入功能微生物菌剂和接种植物共生菌等，强化生态修复效果。