鼻咽癌患者外周血T细胞亚群及活化T淋巴细胞检测中流式细胞术的应用价值探讨

冯睿婷，赵继智

郑州人民医院，河南 郑州 450003

肿瘤免疫学研究表明，机体免疫状态与肿瘤的发生、发展关系密切［1］。大量研究表明，恶性肿瘤患者均存在T淋巴细胞状态异常及比例失调［2］。而T淋巴细胞亚群是机体免疫防御系统的重要组成，具有识别和清除肿瘤细胞的作用，在肿瘤免疫监测中具有重要价值［3］。T淋巴细胞的活化是机体免疫应答的核心，可诱导T细胞活化、增殖及分化，从而对特殊抗原具有直接杀伤作用，并对致敏T细胞所释放的细胞因子具有协同杀伤作用。基于此，本研究旨在探讨采用流式细胞仪检测鼻咽癌患者的外周血T细胞亚群及活化T淋巴细胞的应用价值，结论如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性搜集2018年1月—2019年10月于郑州人民医院就诊的52例鼻咽癌患者临床资料，将其作为试验组，其中男31例，女21例；年龄42～65岁，平均年龄（51.04±4.28）岁；有吸烟史28例；临床分期：Ⅱ期6例，Ⅲ期21例，Ⅳ期25例。纳入标准：纳入病例均经病理检查确诊；符合《中国鼻咽癌分期2017版（2008鼻咽癌分期修订专家共识）》［4］中鼻咽癌的临床分期：Ⅱ-Ⅳ期；卡氏评分＞60分，预计生存周期＞6个月；临床资料完整。排除标准：合并严重传染性疾病、其他恶性肿瘤者；放疗禁忌症者；中途退出治疗者；病情不稳定，恶化速度加快，病情危重者。另选取同期体检健康者50例作为对照组，其中男30例，女20例；年龄41～64岁，平均年龄（51.26±4.33）岁。两组间性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂： FACScalibur流式细胞仪及配套Simultest IMK-Lymphocyte双色免疫荧光试剂盒（美国Bection Dickinson公司）；PREP全自动溶血仪（美国Beckmancoulter公司），鼠抗人单克隆抗体CD4+/CD8+/CD3+、CD3+/CD（16++56+）、CD3+/HLA-DR、CD8+/HLA-DR，ABC溶血素。

1.2.2 检测方法：采集所有入选者清晨空腹肘静脉血3 ml，置于EDTA-K2抗凝真空试管中，取2支试管分设为对照管（正常人群）和试验管（鼻咽癌患者），分别加入100μL血，各加入20μL荧光素标记的鼠抗人单克隆抗体CD4+/CD8+/CD3+、CD3+/CD（16++56+）、CD3+/HLA-DR、CD8+/HLA-DR，充分混匀。避光孵育30 min后加入2 ml溶血素，静置8～12 min后，利用离心机以1 000 r/min离心处理5 min，除去上清液，加入2 ml磷酸缓冲液（PBS）洗涤，除去上清液，重复2次。之后再加入1 ml PBS，利用流式细胞仪自动检测标本T细胞亚群及活化T淋巴细胞。

1.3 统计学方法

数据应用SPSS 20.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血T细胞亚群测定比较

试验组CD3+、CD4+水平低于对照组，CD8+、CD（16++56+）水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 外周血T细胞亚群测定比较（±s） %

表1 外周血T细胞亚群测定比较（±s） %

组别试验组（n=52）对照组（n=50）tP CD3+57.54±12.43 64.61±10.51 3.092 0.003 CD4+25.82±6.87 36.11±6.83 7.698 0.000 CD8+36.34±10.57 27.22±6.34 4.105 0.000 CD（16++56+）28.23±12.41 21.81±8.87 2.995 0.003

2.2 活化T淋巴细胞测定比较

试验组CD3+/HLA-DR、CD8+/HLA-DR水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 活化T淋巴细胞测定比较（±s） %

表2 活化T淋巴细胞测定比较（±s） %

组别试验组（n=52）对照组（n=50）tP CD3+/HLA-DR 33.54±9.48 12.43±7.43 12.484 0.000 CD8+/HLA-DR 37.53±9.42 15.11±6.26 14.099 0.000

3 讨论

T细胞亚群中辅助性T细胞CD4和抑制性T细胞CD8的动态平衡与相互制约是机体免疫功能运行正常的关键，也是维持机体免疫内环境与肿瘤微环境稳定的关键［5］。研究证实，T细胞亚群及活化T淋巴细胞在肿瘤的发生、发展中发挥重要的免疫调节作用［6］。

流式细胞术是临床定量分析和分选单细胞或其他生物粒子的检测手段，主要是通过快速测定荧光信号、侧向角散射及光吸收、前向角散射，从而定量检测细胞中DNA含量、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体、表面抗原及细胞体积等多种参数，并依据各参数结果，快速、准确、可重复性的分离不同性质的细胞，以获得研究所需的纯细胞群体，也是便捷评估、检测肿瘤患者机体免疫状态的有效手段［7］。本研究中应用该方法检测鼻咽癌患者T细胞亚群，发现CD3+、CD4+淋巴细胞明显低于正常群体，CD8+、CD（16++56+）明显高于正常群体，提示鼻咽癌患者的免疫功能低于正常群体，T细胞亚群可作为肿瘤疗效及预后的参考指标之一。分析其原因，肿瘤免疫反应主要是以T细胞亚群为主导的细胞免疫反应，CD4+淋巴细胞可辅助T细胞分化，促进单核巨噬细胞发挥抗感染作用，从而促进细胞毒性T细胞增殖，提高杀菌作用［8］；CD8+淋巴细胞抑制T细胞及杀伤性T细胞，降低患者免疫应答。当CD4+水平降低时，机体细胞免疫功能低下，抗癌能力下降；CD8+水平升高，可使肿瘤细胞发生、发展，并快速恶化、转移［9］。同时应用流式细胞术检测鼻咽癌患者的活化T淋巴细胞，发现，CD3+/HLA-DR、CD8+/HLA-DR水平明显高于对照组，提示活化T淋巴细胞也可作为恶性肿瘤免疫诊断的指标之一。分析其原因，CD3是人类T细胞分化抗原，HLA-DR是主要组织相容复合体Ⅱ型MHC分子，其抗原主要表达于B淋巴细胞、活化T淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞等，当机体发生感染、抑制免疫排斥反应时均易导致T淋巴细胞活化，故HLA-DR+T淋巴细胞可反映活化T细胞含量，并可评估T细胞活化状态及活化效率，对评估肿瘤患者免疫活化状态具有重要的临床参考价值［10］。

综上所述，鼻咽癌患者的免疫功能低于正常人群，而采用流式细胞术检测患者的外周血细胞亚群及活化T淋巴细胞，可有效反映患者肿瘤的免疫活化状态及病情变化，具有重要临床价值。