二化螟对薄荷精油化学成分的电生理及行为反应

杨 雪 ，胡 阳，王梓懿 ，王照国 ，余 帅，安正斌，夏 宇，李䶮

（1.贵州医科大学省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州 贵阳 550014；2.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室/贵州省天然药物工程研究中心，贵州 贵阳 550014；3.贵州省农业科学院植物保护研究所，贵州 贵阳 550006）

【研究意义】二化螟（Chilo suppressalisWalker）是鳞翅目草螟科的一种害虫。二化螟幼虫作为钻蛀性及寡食性害虫，主要为害水稻及茭白等禾本科作物。二化螟属兼性滞育种类，以4～6龄幼虫在稻蔸滞育越冬，平均每年发生1～5代，江淮稻区常年发生2代［1］。在水稻苗期二化螟幼虫的为害可造成水稻苗枯鞘和枯心等症状，在水稻孕穗期和穗期二化螟幼虫的为害会造成稻苗白穗、枯孕穗和虫伤株等症状，严重降低水稻的产量和质量［2］。最近几年二化螟种群的数量呈现出一定的回升趋势，主要原因包括其寄主植物的种植规模越来越大、水稻种类的替换、耕作方式发生改变以及气候的变化等，其为害性逐年加剧，故有人将其与蝗虫并列，称它们为“南螟北蝗”［3］。目前对二化螟的防治主要依赖于化学药剂，而长期以及连续不合理的使用化学药剂使得二化螟对其产生了不同水平的抗药性［4］。因此，寻找环境友好型防治二化螟的措施十分必要和迫切。

【前人研究进展】随着目前化学生态学的快速发展，对于植物与昆虫之间产生的化学信息联系的研究成为新的重点研究领域之一。植物精油中含有多种低沸点、易挥发的成分，且具有强烈的特殊气味。植物精油按一定比例构成化学指纹图谱，并能够影响昆虫对于寄主植物的定位、逃避敌害、交配、产卵、取食等行为，在昆虫行为调控和植物防御过程中起着重要作用［5］。薄荷（Mentha haplocalyxBrig.）为唇形科多年生草本植物，其入药部分为地上干燥部分。夏秋二季茎、叶茂盛或花开至三轮时，选晴天，分次采割，阴干或晒干，其性辛、凉，归肺、肝经。具有疏散风热、清利头目、利咽、透疹的作用、用于风热感冒、风温初起、头痛、目赤、喉痹、口疮、风疹、麻疹、胸胁胀闷等［6］，我国南北各省均有分布，主产于江苏、江西、湖南等省。据报道，薄荷精油对白纹伊蚊（Aedes albopictus）具有驱避作用，活性成分为右旋8-乙酰氧基别二氢葛缕酮［7］。李中姗等研究了香草根挥发油中萜类化合物对二化螟具有引诱作用［8］。郑许松等通过二化螟在香草根和水稻之间产卵和幼虫存活的情况进行研究，发现二化螟更倾向于将卵产在香草根上，表明二化螟对香草根具有强烈的吸引作用［9］。高广春等研究表明香草根提取物对刚孵化的二化螟幼虫具有一定的毒杀活性［10］。王广利等报道二化螟对16 种香草根挥发物产生EAG 反应［11］。查阅文献，我们可以得知很多研究者都是对薄荷精油的抗菌和防腐作用的研究。Espiritu 等报道了薄荷甲醇提取物对大肠杆菌具有显著的抑制作用［12］。野生薄荷精油清除超氧阴离子自由基和羟基自由基的能力较强［13］。另外，He 等从薄荷精油中分离出25 个葡萄糖苷类化合物，活性测定结果显示这些化合物对葡萄糖苷酶具有抑制活性［14］。薄荷属植物椒样薄荷（Mentha piperitaL.）和苏格兰留兰香（Mentha cardiacG.）精油可抑制多种细菌的生长，该2 种薄荷植物提取精油后，所剩余残渣的甲醇提取物DPPH 自由基具有较强的清除作用［15］。

【本研究切入点】薄荷精油中含有丰富的的萜类化合物，同时薄荷精油对二化螟行为研究未见报道。通过前期对实验室所提取的全部精油筛选出了薄荷精油对二化螟有取食引诱活性。因此本试验测试了薄荷精油对二化螟幼虫的取食趋向的影响，在此基础上，测试了二化螟对薄荷精油的触角电位反应，并采用气相色谱-触角电位联用仪（GC-EAD）分析了薄荷精油中的活性成分，为揭示薄荷精油调控农业害虫的行为提供依据。【拟解决的关键问题】薄荷精油是否对二化螟的取食有影响，薄荷精油中不同化合物对二化螟雌雄成虫是否产生电生理反应。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试虫源：二化螟三龄幼虫由贵州省农业科学院植物保护研究所室提供，二化螟成虫由南京农业大学植物保护学院提供。

植物材料：留兰香薄荷地上部分于2018 年4月采自贵州省贵阳市沙文，阴干备用。

主要仪器：GC-EAD 系统由装有HP-5（30 m×0.25 mm）色谱柱、FID 检测器的气相色谱（Angilent 5890 B）和触角电位仪（Syntech）组成。触角电位仪由荷兰Syntech 公司生产的智能化数据获取控制器IDAC-4、微动操作仪Syntech MN-151、刺激气流控制器Syntech CS-55 和Syntech软件处理系统组成。

主要试剂：正己烷（分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司），配制成0.1、1、10、100、1000、10000 mg/L 6 个浓度梯度。乙醚、丙酮（分析纯，天津富宇精细化工有限公司），无水硫酸钠（分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 精油提取 采用水蒸气蒸馏法提取薄荷精油：将采集的薄荷样品粉碎，过0.850 mm筛，称量500 g，置1000 mL 圆底烧瓶中，加水500～900 mL，浸泡12 h，组装好水蒸气蒸馏装置。用电加热套缓缓加热圆底烧瓶至沸腾，并一直保持微沸的状态约5 h，直至无油状物流出为止。用等体积的乙醚萃取馏出液3 次，合并乙醚层，用无水硫酸钠进行干燥，过滤掉无水硫酸钠，用旋转蒸发仪去除乙醚，得到薄荷精油，在4 ℃密封保存备用。

1.2.2 二化螟幼虫非选择性拒食活性测试 采用称重法测试拒食活性［16］：选取三龄二化螟幼虫为测试昆虫，将受试昆虫饥饿24 h，逐头编号称重，以丙酮为溶剂，采用二倍稀释法将薄荷精油配制成5.0、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625 mg/mL的系列浓度。以丙酮溶液为对照，每个浓度3 次重复，每个重复10 头试虫。选取新鲜稻茎，切割成2 cm，在药液中浸渍5 s，自然晾干后放入培养皿中，接入1 头试虫，每天更换带药稻茎，饲养7 d，取出称重，计算拒食率。

1.2.3 气相色谱-触角电位联用仪（GC-EAD）测试 样品用GC-EAD 进行分析［17］，每次进样量为2 μL（浓度为10 mg/mL），进样口温度220 ℃，检测器温度250 ℃，载气为流速 1 mL/min 的99.999% N2，不分流进样。升温程序：初始温度从50 ℃保持2 min，以升温速度10 ℃/min 升至210 ℃，再以10 ℃/min 的速度升至280 ℃，运行25 min，柱前压7.65 psi，载气流量1.0 mL/min，分流比20 ∶1，溶剂滞后时间 4.0 min。将羽化后2 d 的成虫触角剪下，接到触角电位仪上，测试方法同上。

质谱条件：电子能量70 eV，离子源为EI源，EI 源温度230 ℃，发射电流34.6 μA，四极杆温度150 ℃，倍增器电压1482 V，质量范围29～500 amu。

采用气相色谱-质谱-计算机联用仪进行分析鉴定，各峰经质谱计算机数据系统检索，标准图谱库Nist 2005 和Wiley 275，确定精油中的化合物结构，用峰面积归一化法确定各化学成分的相对含量。

2 结果与分析

2.1 二化螟幼虫非选择性拒食活性

表1 为不同浓度薄荷精油对二化螟三龄幼虫的拒食活性。由表1 可知，所有测试浓度均表现出显著的引诱取食作用，且随着浓度的降低，引诱取食作用越强。当浓度为0.15625 mg/mL 时，取食率为123.01 %，故选取0.1 mg/mL 薄荷精油用于测定二化螟雌雄成虫触角电位反应的浓度。

表1 不同浓度薄荷精油对二化螟幼虫的引诱取食活性Table 1 Feeding attraction activities of different concentrations of essential oil of Mentha haplocalyx against Chilo suppressalis

2.2 薄荷精油化学成分分析

图1 为薄荷精油GC-MS 离子流。由表2 可知，从薄荷精油中共检测出27 个化合物，化合物含量占总含量的81.965 %，其中含量最多的为长叶薄荷酮，含量为15.854 %，其次为异薄荷脑，含量为15.206 %。氧化胡椒酮和顺-胡椒酮氧化物的含量分别为13.044 %和12.655 %，异薄荷酮含量为9.067 %，其余化合物含量均较低。因长叶薄荷酮为薄荷精油的主要化合物，故测试了薄荷精油和长叶薄荷酮对二化螟雌雄成虫的触角电位反应。

图1 薄荷精油GC-MS 离子流Fig.1 Ion flux of essential oil of Mentha haplocalyx

表2 薄荷精油主要化学成分Table 2 Chemical components of essential oil of Mentha haplocalyx

2.3 薄荷精油对二化螟雌雄成虫气相色谱-触角电位联用仪（GC-EAD）电位反应

二化螟雌性成虫对薄荷精油的GC-EAD 反应见图2，结果显示薄荷精油中的12 种化合物能明显引起雌虫产生电生理反应，其中长叶薄荷酮的反应最为强烈，12 号未知物对二化螟雄虫也有较明显的反应，从GC-MS 分析可以看出，12 号未知物为菖蒲烯（0.489 %）、乙烯丁香酚（0.151 %）、4-环丙基-2-甲氧基苯酚（1.929 %）的混合物，它们的总含量仅为2.569 %，与长叶薄荷酮（15.854 %）的含量差别较大，故推测3 个化合物中的某个化合物对二化螟雄虫的触角电位有更大反应。

图2 二化螟雌性成虫对薄荷精油的GC-EAD 反应Fig.2 Gas chromatography-electroantennographic detection（GC-EAD）response of female adults of Chilo suppressalis to essential oil of Mentha haplocalyx

二化螟雄性成虫对薄荷精油的GC-EAD 反应见图3。与雌虫不同，雄虫对薄荷精油中的10 种化合物产生电生理反应，其中丁子香酚对二化螟雄虫的电生理反应最为强烈。结合GC-MS 分析可知，丁子香酚旁的为薄荷烯酮醚，其对二化螟雄虫的电生理反应影响也较为强烈。另外，丁子香酚在薄荷精油中的含量为11.692 %，而薄荷烯酮醚的含量仅为2.766 %，推测薄荷烯酮醚对二化螟雄虫的电生理反应较丁子香酚强烈。

3 讨论

图3 二化螟雄性成虫对薄荷精油的GC-EAD 反应Fig.3 Gas chromatography-electroantennographicdetection（GC-EAD）response of male adults of Chilo suppressalis to essential oil of Mentha haplocalyx

昆虫的取食行为是指昆虫在接受内外信息后，由神经系统和肌肉系统作出的综合反应，表现出摄取食物以及与此相关的一系列活动［18］，一般同种昆虫个体的取食行为既表现出种群的相似性又表现出种群所特有的固定模式。昆虫对食物有一定的选择性，用以识别和选择食物的方式多种多样，但多以化学刺激作为识别寄主的主要工具，昆虫的取食行为取决于从化学感受器输入的感觉信号，如植食性昆虫通常以植物的次生代谢产物作为信息化合物或取食刺激剂［19］。昆虫在觅食和寻找寄主行为中，嗅觉感受器发挥着极其重要的作用，即通过嗅觉感受植物挥发物以识别寄主及确认取食适合度，昆虫可通过味觉感受系统辨别促进取食的营养化合物和抑制取食的有毒化合物以确认和评估潜在食物［20］。芳香植物的气味可影响昆虫的行为［21-23］，从具有特殊气味的植物中筛选出可显著影响昆虫行为的挥发性物质，是利用化学生态调控害虫的主要研究方向之一。气相色谱-触角电位（GC-EAD）是昆虫化学生态学中最重要的电生理技术，在研究昆虫对信息化学物质的感受机理、筛选活性信息素成分或植物次生物质等方面发挥关键作用。

长叶薄荷酮在多种芳香植物的精油中被检测出［24-27］，丁子香酚是植物丁香、丁香罗勒以及樟树属肉桂叶挥发油的主要成分，呈现出特殊辛辣味和强烈的丁香气息［28］。丁子香酚抑菌活性较好，目前已有相关杀菌剂应用于农业实践中。本试验测试的薄荷精油中的异薄荷脑、氧化胡椒酮、顺-胡椒酮氧化物、异薄荷酮含量也较高，但GC-EAD 结果显示这些化合物对二化螟雌雄成虫触角的电生理反应不是很强烈。雌雄虫触角上化学感受器数量和类型有差异，导致雌雄虫各自具备独特的嗅觉感受和分辨能力，也可能与嗅觉感受器中相关嗅觉蛋白与精油中某种活性成分的结合能力有关。在自然界中，昆虫雌雄个体在整个种群生存和繁衍过程中长期分工不同，也会导致其对植物气味的反应在两性间存在明显的差异。在GC-EAD 测试中，作为刺激源的每种柱流出组分的量是不相同的，有可能会出现有行为活性的组分在样品中含量太低而没有触角电位反应。具有触角电位活性的化合物作为行为实验的材料时，供试昆虫不一定都对其产生趋性反应，主要是由于触角电位反映的是嗅觉感受器对特定化合物反应电压的强弱，而行为反应需要经历嗅觉受体、神经中枢，依据大脑的判断从而对运动器官进行调控。

不同产地、不同采摘时间的薄荷精油化学成分亦不同。王微等报道薄荷精油中异佛尔酮相对含量最高，达到41.22 %［29］。李铁纯等报道采自辽宁省辽中县的薄荷精油中相对含量最高的化合物为香薷酮（58.90 %）［30］。本试验测定结果相对含量最高的为长叶薄荷酮（15.854 %），可能是产地和采摘时间不同所致，推测其生物活性也有差异。

昆虫诱食剂具有引诱害虫取食更多沾有药物的叶片，加速害虫死亡，可提高药效，本研究结果将为开发薄荷精油中的活性化合物为植物源诱食剂奠定基础。

4 结论

本试验测试了薄荷精油对二化螟三龄幼虫的取食影响，结果显示薄荷精油可显著引诱二化螟幼虫取食，考虑到处理组和对照组喂食的均为新鲜稻茎，可以排除味觉对取食变化的影响，故进一步测试了薄荷精油中不同化合物对二化螟雌雄成虫触角的电生理反应。GC-MS 分析结果显示长叶薄荷酮是薄荷精油中的主要化合物。在此基础上，本试验采用GC-EAD 法测试了薄荷精油中不同化合物对二化螟雌雄成虫的电生理反应，结果显示雌虫对长叶薄荷酮的电生理反应最为强烈，而雄虫对丁子香酚的电生理反应最为强烈。