保加利亚乳杆菌的筛选及其发酵乳中的风味物质

李 婷，田佳乐，刘 洋，陈海燕，丹 彤，孙天松

（内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室农业农村部奶制品加工重点实验室 呼和浩特010018）

乳酸菌是指发酵乳糖主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏阳性细菌的总称。其广泛分布于自然界中，一般主要存在于人体、动物体及各种发酵食品中。1905年，Grigoroff 首次从酸奶中分离出保加利亚乳杆菌 （Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）[1]。该菌株是酸奶发酵剂中重要的菌种之一，具有清肠、整肠、提高机体免疫力、抗癌及抗肿瘤等重要的生物学功能[2]。

Kataoka 等[3]研发出一种样品前处理技术-固相微萃取（Solid-phase microextraction，SPME）。SPME 技术具有操作简单、成本低、灵敏度高等优点，广泛应用在风味检测的各个领域。武士美等[4]采用SPME-GC/MS 技术对保加利亚乳杆菌发酵乳中的挥发性风味物质进行分析，鉴定了乙酸、乙醛、双乙酰、乙偶姻、乙酸乙烯酯等多种风味化合物，并筛选出具有优良风味的菌株。Bao 等[5]采用该技术分析干酪乳杆菌（Lactobacills casei）发酵乳中的挥发性化合物，检测出的主要风味化合物有乙酸、丁酸、双乙酰和己酸乙酯等。任为一等[6]采用该技术分析发酵乳中的风味物质，发现双乙酰、乙偶姻、乙醛、2-壬酮等化合物对发酵乳风味贡献较大。

酸奶是一种受消费者喜爱的传统发酵乳制品，然而，关于保加利亚乳杆菌在牛乳发酵过程中产生的风味及其发酵特性的报道较少。本研究以来自蒙古国和西藏传统发酵乳制品中的7 株保加利亚乳杆菌为研究对象，系统考察贮藏12 h 时发酵乳中风味物质的多样性，并测定发酵和贮藏12 h 时的pH 值、滴定酸度（TA）、活菌数和黏度，旨在为传统酸奶发酵剂的基础研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

内标 （Internal Standard，ISTD）1，2-二氯苯，Sigma 公司；全脂奶粉，美国Fonterra 公司；MRS 液体培养基（MRS BROTH），英国Oxoid 公司。

试验菌株：7 株保加利亚乳杆菌由实验室提供。菌株详细信息见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备 将真空冷冻干燥保藏的保加利亚乳杆菌接种于MRS 液体培养基中，连续传3代，使菌株活力达最大。在50 mL 和200 mL MRS液体培养基中扩大培养，离心收集菌体，将菌体重悬于无菌PBS 保护剂中制备菌悬液。取适量蒸馏水加热至50 ℃，加入11.5%全脂乳粉搅拌溶解，当水温升至60 ℃时加入6.5%蔗糖，水合30 min，且温度始终保持在60 ℃，连续均质2 次（65 ℃，15 MPa 和35 MPa），得到的均质乳在95 ℃处理5 min 后快速冷却至42 ℃。将制备好的菌悬液以5×107CFU/mL 的量接种到均质化的全脂乳中，分装至样品瓶，并在42 ℃发酵。待样品的pH 值达到发酵终点4.5，TA 在70～90 °T 时，将样品移至4 ℃贮藏12 h，待测。

表1 保加利亚乳杆菌的来源信息Table 1 Information of L.delbrueckii subsp.bulgaricus

1.2.2 发酵乳的理化特性

1.2.2.1 pH 值和滴定酸度的测定 发酵乳样品用雷磁PHS-3C 型pH 计测量，调整温度在20～22℃范围，平行测量发酵乳的pH 值。

使用电子天平精确称量5 g 发酵乳样品，置于100 mL 锥形瓶中，向锥形瓶中加入40 mL 蒸馏水和3 滴酚酞指示剂，充分摇动。加入0.1 mol/L NaOH 标准溶液滴定至出现微红色且30 s 内不退色。记录加入的NaOH 标准溶液体积。每个发酵乳样品测定3 个平行。计算滴定酸度（TA）的公式（1）如下：

式中：X——发酵乳样品的酸度，°T；c——NaOH 标准溶液浓度，mol/L；v——滴定时消耗的NaOH 标准溶液体积，mL；m——发酵乳样品的质量，g；0.1——酸度理论定义NaOH 溶液的浓度，mol/L。

1.2.2.2 黏度的测定 取40 g 发酵乳样品，用黏度仪的4#转子测定其黏度，转子转速100 r/min，扭矩20%～100%，测定时间30 s，每个样品测定3个平行，取平均值。

1.2.2.3 乳酸菌活菌计数 采用稀释平皿倾注法检测保加利亚乳杆菌发酵乳中活菌数的变化。用0.85%无菌NaCl 对样品进行10 倍梯度稀释，分别取10-5，10-6，10-7的稀释液各1 mL 于无菌培养皿上，37 ℃厌氧培养48 h。

1.2.3 挥发性风味物质的测定 使用Agilent 7890B 气相色谱仪和5977A 质谱仪测定发酵乳中的挥发性风味化合物。将萃取头（50/30 μm 二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷）在Agilent 7890B气相色谱仪进样口（250 ℃）老化5 min，插入气相瓶上方，萃取样品中的风味化合物。萃取条件：温度50 ℃，磁力搅拌器转速300 r/min，萃取时间60 min。柱温：采用程序升温，初始温度35 ℃，保持5 min；以5 ℃/min 升至140 ℃，保持2 min 后以10℃/min 速率升至250 ℃。试验用载气为高纯氦气，载气流速1.0 mL/min，不分流进样。汽化室温度250 ℃。电离方式EI 离子源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，质量扫描范围m/z 35～500，发射电流100 μA，检测电压1.4 kV，无溶剂延迟。

1.2.4 定性与定量分析 利用随机携带Masshunter 工作站NIST 11 标准库自动检索各组分质谱结果，根据保留时间计算挥发性风味化合物的保留指数（retention index，RI）。参考相关文献报道的RI 值鉴定发酵乳样品中的挥发性风味物质。保留指数（RI）值代入公式（2）计算：

式中：RT——保留时间（min）；RT（Z）、RT（Z＋1）和RT（X）分别为正构烷烃碳原子数为Z、Z＋1 和待测物X 的保留时间，且正构烷烃碳原子数的保留时间遵循RT（Z）

将1，2-二氯苯溶液作为ISTD 加入发酵样品中，采用峰面积归一化法计算所有组分的相对峰面积比。样品中各组分风味物质的浓度代入公式（3）计算：

式中ci——试验样品中各挥发性风味化合物的质量浓度，μg/L；cs——1，2-二氯苯的质量浓度，μg/L；Ai——样品中待测物质对应的色谱峰面积；As——ISTD 的色谱峰面积。

1.2.5 关键挥发性风味物质的评价 为确定发酵乳中的挥发性风味化合物，采用香气活度值（odor activity value，OAV）准确评价单一香气成分对整体风味贡献程度。OAV 是指香气成分的浓度与其在水中的感觉阈值的比值。OAVi计算公式（4）：

式中：OAVi——风味化合物i 的香气活度值；Ci——发酵乳中挥发性风味化合物的质量浓度，μg/L；OTi——所测风味化合物在水中的气味阈值。

1.3 数据分析

使 用Microsoft Excel、SIMCA-P、Origin 等软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 保加利亚乳杆菌的发酵特性

7 株保加利亚乳杆菌在发酵和贮藏12 h 时pH、TA 的变化情况如图1a、b 所示。在牛乳发酵过程中，所有样品的pH 值呈缓慢下降的趋势。其中，IMAU62115 的发酵时间最短，仅用7 h 达到发酵终点 （pH 4.5）。IMAU62121 的发酵时间较长，13 h 达到发酵终点。从图1b 看出，滴定酸度与pH 值的变化相反，随着时间延长，所有发酵乳样品的TA 值呈缓慢升高的趋势。其中，在贮藏12 h时，IMAU62115 发酵乳的TA 值达到最高值，即95°T，其余6 株菌株发酵乳的TA 值相对较低，分别为94，93，92，90，84，74°T。

图1 各组发酵乳pH、TA、活菌数、黏度随发酵和贮藏时间变化曲线Fig.1 The curve of pH, TA, viable count and viscosity of fermented milk with fermented and storage time

7 株保加利亚乳杆菌在牛乳发酵过程中活菌数的变化如图1c 所示。国际乳品联合会（International Dairy Federation，IDF）规定在贮藏、运输和销售过程中发酵乳产品的活菌数应达到107CFU/mL 以上。在本试验中，贮藏12 h 时，7 株保加利亚乳杆菌的活菌数均在108CFU/mL 以上，其中IMAU62115 发酵乳样品中活菌数最高，达4.95×108CFU/mL。这一结果说明本试验用发酵剂菌株在发酵及贮藏过程中能保持良好的活力，可用于发酵剂的研发。

黏度是评价发酵乳质构及口感的一项重要指标，图1d 显示7 株保加利亚乳杆菌在发酵过程中黏度的变化。由图1d 可知，随着发酵时间的增加，黏度逐渐升高。特别是在贮藏12 h 时，IMAU20220 和IMAU62115 发酵乳的黏度分别达到966 mPa·s 和820 mPa·s，优于其它菌株。

2.2 保加利亚乳杆菌发酵乳风味物质

贮藏12 h 时，从7 株保加利亚乳杆菌发酵乳中共检测到54 种挥发性风味物质，主要包括酸、醛、酮、醇及酯类风味化合物（表2）。采用香气活度值（odor activity value，OAV）法鉴定出14 种关键性风味化合物（表3）。通常，0.1≤OAV＜1 的风味化合物对发酵乳总体风味的形成起重要修饰作用，OAV≥1 的化合物对发酵乳风味起主要贡献作用。

酸类化合物是发酵乳的主要呈味物质，来源于脂肪分解、蛋白质水解等代谢途径[7]。由表2可知，3 株保加利亚乳杆菌（IMAU20396、IMAU62115、IMAU20220）发酵乳酸类化合物的种类和含量明显高于其它菌株，特别是IMAU62115发酵乳中酸类化合物的总含量最高，达243.98 μg/L。在保加利亚乳杆菌发酵乳中检测到一些重要的挥发性酸类物质，如乙酸、3-甲基丁酸、己酸等[8]。其中，IMAU62115 发酵乳中检测到的乙酸、3-甲基丁酸、己酸的含量均高于其它菌株。类似的结果在Pereda 等[9]和Pogacˇic等[10]的研究中也有发现。

醛类化合物是发酵乳中的关键性风味物质，主要通过氨基酸降解而产生[11]。由表2和表3可知，3-甲基丁醛和癸醛的OAV 值大于1。贮藏12 h 时，IMAU20234 和IMAU62115 发酵乳中3-甲基丁醛含量最高，分别为16.7 μg/L 和14.3 μg/L；仅在IMAU20220 发酵乳中检测到癸醛，含量为1.09 μg/L。此外，有5 种挥发性风味物质的OAV 大于0.1，分别为乙醛、庚醛、正庚醛、苯甲醛、正壬醛。在醛类化合物中，乙醛是重要的风味化合物，对发酵乳的风味影响较大[12]。在IMAU62115、IMAU20227、IMAU20234 和IMAU20403 发酵乳中均检出乙醛，其含量分别为6.52，32.91，35.85，36.44 μg/L。苯甲醛是乳制品中常被检测到的重要化合物。Chu 等[13]认为低浓度的苯甲醛能赋予发酵乳杏仁香味，而浓度较高时，能赋予发酵乳水果香气。贮藏12 h时，IMAU20403、IMAU20396、IMAU62115 发酵乳中苯甲醛含量分别为3.71，3.82，3.19 μg/L，显著高于其它菌株。庚醛赋予发酵乳脂肪香味[14]，正壬醛赋予发酵乳柑橘和脂肪香味[15]。

酮类化合物主要来源于不饱和脂肪酸降解、氨基酸降解或微生物代谢[16]。保加利亚乳杆菌发酵乳被检出的酮类化合物有12 种（表2，表3），其中，2，3-丁二酮（双乙酰）和2-壬酮的OAV 值大于1，是关键性风味化合物。特别是IMAU62115发酵乳中双乙酰的含量为38.54 μg/L，远高于其它菌株发酵乳中双乙酰的含量。双乙酰是发酵乳风味形成的关键芳香化合物，赋予发酵乳醇厚的奶油香味[17]。2-壬酮能赋予发酵乳奶油味和水果香味[18]。

醇类化合物的生成可能与乳糖代谢、甲基酮还原、氨基酸代谢、亚油酸和亚麻酸降解有关[19]。本研究中共检出18 种醇类化合物，其中，关键性（OAV≥1）醇类风味物质仅有1 种，为3-甲基丁醇。3-甲基丁醇是形成发酵乳风味的重要物质，如Galvao 等[20]在水果中检测到3-甲基丁醇，认为该物质可赋予人愉悦的酪香味。Cheng 等[21]也认为1-壬醇是发酵乳中的主要风味物质。IMAU20403、IMAU20396、IMAU62115 发酵乳中1-壬醇的含量最高，分别为2.75，2.78，2.57 μg/L。

IMAU 20234-----10.99 1.46-7.71-2.94-35.85-16.7-0.68 1.99 2.96-0.85 6.36-5.21 7.37 10.95果结定鉴GC-MS的质物味风性发挥中乳酵发菌杆乳亚利加保的12 h藏贮2表Volatile compounds produced from milk fermented by L.delbrueckii subsp.bulgaricus by SPME-GC-MS during 12 h storage Table 2 -1·L/μg度浓量质质物性发挥IMAU IMAU IMAU IMAU IMAU IMAU c考参RI b RI a RT式子分称名文中20227 20220 62115 62121 20396 20403物合化类酸-10.87 26.61-12.29 4.24 638 630.53 2.7 O 2 H 4 C 2酸乙-45.68---18.94-704.5 3.74 O 3 H 4 C 3酸酮丙--18.67-21-767 764.24 5.48 O 2 H 8 C 4酸丁异0.83-5.78---793 802.79 6.74 O 2 H 8 C 4酸丁--3.63-2.81--869.49 9.16 O 4 H 10 C 6酸二丙8.94 50.8 154.96-89.74 42.97 875 875.8 9.4 O 2 H 10 C 5酸丁基甲3-1.97 4.72--8.23 2.39-884.2 9.72 O 2 H 14 C 7酸己基甲2--15.43-----886.77 9.81 O 2 H 10 C 5酸丁基甲2-11.5 11.73 23.63 2.44 14.03 14.22 999 998.1 13.95 O 2 H 12 C 6酸己--2.24 0.35--）（SE-30 1 128.13 1 127 18.21 O 2 H 12 C 7酸羧烷己环6.83 8.53 8.46 0.44 6.25 7.09 1 188 1 187.24 20.01 O 2 H 16 C 8酸辛-1.04-----1 292.73 23.03 O 2 H 18 C 10酸烯癸3-物合化类醛32.91-6.52--36.44--1.34 O H 4 C 2醛乙7.78 2.84-1.14 5.51 4.31-633.61 2.74 O 2 H 8 C 4醛丁基羟3-13.85 9.05 14.3 0.42 8.16 13.24 689 686.89 3.44 O H 10 C 5醛丁基甲3----5.83--687 687.19 3.45 O H 10 C 5醛戊正0.92 0.58-0.35---774.92 5.79 O H 14 C 7醛庚2.45 1.69 2.51 2.12 6.58 6.09 801 801.84 6.59 O H 12 C 6醛庚正2.8 1.95 3.19 2.11 3.82 3.71 964 963.72 12.68 O H 6 C 7醛甲苯-1.09-----1 109.98 17.65 O H 20 C 10醛癸1.07--0.32-1.59 1 110 1 110.24 17.66 O H 18 C 9醛壬正物合化类酮2.34 7.18-2.72 9.04-1 083 1 076.97 16.58 O H 12 C 8酮-2-醛烯二辛，5--3，反反--38.54-----2.14 O 2 H 6 C 4）酰乙（双酮二丁，3-2-12.26-2.5 114.38---2.15 O H 10 C 5酮丁-2-基甲3-9.12 4.13 5.86 1.9 8.31 8.98 672 673.01 3.26 O H 10 C 5酮戊2-11.73 61.32 115.9-88.56 72.58-706.75 3.81 O 2 H 8 C 4姻偶乙号序1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5

IMAU 20234-44.87-5.08 17.1 1.75 1.15 64.44--1.2-7.96--6.78-7.51-1.28----1.52---应对到找查中IMAU 20227 0.55 59.71--19.24 2.21 1.2-5.04--1.5 11.34--7.59 1.62 9.53-1.81-0.77 0.8-1.9--2.18库据数该在-1/μg·L 度浓量质质IMAU IMAU 20220 62115--43.3--66.09-9.75 21.47 18.22 2.35 2.22 0.93-35.54 2.56-3.99 3.58-----7.28 5.67 0.87-1.08 2.26----7.11 11.7 1.72-0.48 1.72--0.66------2.57----1.85-未；-.数指留保考参应对物性发挥IMAU IMAU IMAU c考参RI b RI 62121 20396 20403--3.26 735 733.21 14.96 83.21 80.69 894 895.78----896.13--12.58 1 076 1 077.09 5.25 39.28 33.29 1 096 1 098.04 0.6 3.57 3.46 1 298 1 300.99 0.48 1.68 2.21 1 504 1 504.82物合化类醇-----0.94 6.7--693.12-2.93--717.64 1.06---719.12 0.39--726 721.87--5.89 760 763.76-4.9--765.21 0.28 2.15--784.4 1.52-9.42 876 876.02---909 907.2 2.91 10.14 12.5 975 976.79----1 106.99-2.05 2.08 1 107.11 1 102（DB-5）0.41---1 107.17 0.2-1.15-1 108.28----1 113.42--1.32-1 132.26 0.84 2.78 2.75 1 176 1 178.34物合化类酯--4.63 870 876.09-3.63--1 701.52-1.55 2.5-1 504.6的到找查）中：//webbook.nist.gov/chemistry（http库据数数指留保在；c.数a RT式子分4.58 O H 8 C 5 10.16 O H 14 C 7 10.17 O H 14 C 7 16.59 O H 12 C 8 17.28 O H 18 C 9 23.26 O H 22 C 11 28.92 O 2 H 18 C 10 2.14 O H 8 C 4 3.52 O H 14 C 7 4.13 O H 12 C 5 4.17 O H 10 C 5 4.25 O H 10 C 5 5.46 O H 12 C 5 5.51 O 2 H 12 C 6 6.06 O H 8 C 5 9.41 O H 14 C 6 10.58 O H 16 C 7 13.16 O H 16 C 7 17.56 O H 20 C 9 17.56 O H 20 C 9 17.57 O H 26 C 12 17.6 O H 22 C 10 17.76 O H 16 C 8 18.33 O H 16 C 9 19.74 O H 20 C 9 9.41 O 2 H 14 C 7 32.8 O 2 H 36 C 18 28.92 O 2 H 16 C 9指留保得所算计烃烷构正）2表（续称名文中号序酮-2-烯戊-3-反6酮庚2-7酮己-2-基甲5-8酮-2-烯二辛，5-3 9酮壬2-10酮一2-十11酮-2-喃吡氢四-2H-基戊6-12醇丁环1醇己环基甲-4-反2醇丁-2-基甲3-3醇-1-烯戊4-4-1-醇烯-3-丁基3-甲5醇丁基甲3-6醇己氧环，3-2 7醇烯戊-2-式反8醇己正9醇庚2-10醇庚1-11醇-2-庚基5-乙12醇2-壬13醇辛基丁2-14醇庚-1-基丙2-15醇己环基甲二，5 2 16醇炔-3-庚-1-基甲二，6-3 17醇壬1-18酯己酸甲1酯基，壬酸壬2酯内壬δ-3列系一～C 25 C 6由）；b.（min间时留保：a.。数指留保考参注的

表3 保加利亚乳杆菌发酵乳中关键性风味物质及对应OAV 值Table 3 OAVs for different compounds produced by milk fermented by L.delbrueckii subsp.bulgaricus

酯类物质主要通过脂肪酸和醇酯化产生。本研究中检测到的酯类物质种类较少，仅在IMAU20403 发酵乳中检出甲酸己酯 （4.63 μg/L），该化合物可赋予发酵乳果香味。类似的研究结果Mariaca 等[22]也有报道。

结合表3中关键性风味物质的OAV 值，对贮藏12 h 发酵乳中的风味物质（OAV≥0.1）进行主成分分析，结果表明菌株与香气成分越接近，两者的相关性越高。由图2和图3可知，左半区菌株（IMAU20220、IMAU20227、IMAU20234、IMAU62121）与庚醛、3-甲基丁醇、癸醛（OAV≥0.1）有较强的相关性，右半区菌株（IMAU20396、IMAU20403、IMAU62115）与3-甲基丁酸、乙醛、3-甲基丁醛、3-羟基丁醛、正庚醛、苯甲醛、正壬醛、2，3-丁二酮、乙偶姻、2-庚酮、2-壬酮等11 种OAV≥0.1 的风味物质有较强的相关性。这说明不同菌株产生的关键性风味物质不同，使发酵乳呈现出不同的风味特征。

图2 贮藏12 h 时发酵乳样品的主成分得分图Fig.2 Score scatter plot of fermented milk during storage 12 h

图3 贮藏12 h 时发酵乳样品的风味物质载荷图Fig.3 Loading scatter plot of volatile components during storage 12 h

3 结论

以分离自蒙古国和我国西藏传统自然发酵乳制品中的7 株保加利亚乳杆菌为对象，测定这些菌株的pH 值、滴定酸度、活菌数和黏度等理化指标，用SPME-GC-MS 方法分析7 株保加利亚乳杆菌发酵乳中的挥发性风味物质。结果表明，IMAU62115 的发酵时间最短，仅用7 h 达到发酵终点（pH 4.5），贮藏12 h 时，样品活菌数达到最高，4.95×108CFU/mL，滴定酸度95 °T，黏度820 mPa·s。各菌株挥发性风味物质比较、OVA 主成分分析结果显示：在保加利亚乳杆菌IMAU62115 发酵乳中共检测出26 种风味物质，包括酸类、醛类、酮类、醇类及酯类化合物等。其中关键性风味化合物双乙酰、乙偶姻、3-甲基丁醛、2-壬酮等浓度较高，OAV 值大于1，说明这些化合物对保加利亚乳杆菌IMAU62115 发酵乳的风味贡献较大，使发酵乳风味优良。本研究筛选的保加利亚乳杆菌IMAU62115 菌株，具有良好的发酵特性，IMAU62115 发酵乳产生的关键性风味物质使发酵乳的风味优良，为酸奶发酵剂的开发提供试验依据。