副猪嗜血杆菌银杏叶黄酮苷佐剂疫苗对小鼠免疫功能的影响

叶碧锦，刘 栋，赖连杰，刘 星，张秋娟，尹会方,2 ，李晓华，2，3

(1.龙岩学院；2.福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室；3.福建省生猪疫病防控工程研究中心 福建龙岩 364000)

副猪嗜血杆菌(HPS)是当前危害保育猪最严重的细菌病之一[1]。随着集约化养殖的飞速发展，猪群饲养密度越来越高，本病危害日益严重，成为全球范围内危害养猪业的典型细菌性疾病之一，且呈逐年上升的趋势[2]，给猪场带来严重损失。近年来抗生素的滥用导致副猪嗜血杆菌(HPS)的耐药性越来越普遍，采用疫苗免疫成为防治副猪嗜血杆菌病经济而有效的途径。在副猪嗜血杆菌杆菌灭活苗研制中，选用能显著提高体液免疫作用的佐剂对提高疫苗的效力起着重要作用[3]。杨飞等[4]研究表明，疫苗佐剂能够调节细胞因子的分泌，增强机体的免疫功能。张继东等[5-6]研究表明，一些中药具有增强和调节免疫的作用，能促进动物免疫器官的发育，增强机体的细胞免疫和体液免疫功能。

银杏是一种具有很高药用价值的古老孑遗植物。近年来研究发现，银杏叶提取物对机体的免疫功能有很大的促进作用，银杏叶提取物能调节细胞因子的分泌来增强机体的免疫功能。张申等[7]研究发现，银杏叶提取物具有抗炎抗氧化应激的作用，使IL-1、IL-6、TNF-α和COX-2分泌水平趋于正常，调控炎症因子在病菌感染时过度表达而使机体功能受损，维持机体的平衡稳态。将银杏叶提取物作为佐剂疫苗治疗手段，大大提高畜禽动物的存活率。李晓华等[5]应用银杏叶黄酮苷作为副猪嗜血杆菌5型灭活疫苗的佐剂研究发现，添加一定剂量的银杏叶黄酮苷对仔猪的免疫调节有促进作用；可以刺激机体产生 IL-2、IL-4细胞因子，对仔猪有一定的免疫促进作用。为了探索银杏叶黄酮苷作为副猪嗜血杆菌灭活疫苗佐剂的可行性，本次试验以小鼠为动物模型，应用自制副猪嗜血杆菌血清4型银杏叶黄酮苷佐剂疫苗免疫小鼠，用血清4型副猪嗜血杆菌强毒株攻毒，通过观察小鼠保护率，测定小鼠IgG抗体、小鼠外周血T淋巴细胞水平及IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ等细胞因子的水平，研究银杏叶黄酮苷作为疫苗佐剂的应用效果，以期为开发中草药疫苗佐剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验菌株：副猪嗜血杆菌血清4型菌株分离自龙岩某猪场，现存于福建省生猪疫病防控工程研究中心实验室。

实验动物：Balb/c实验鼠，雌雄各半，体重22～25 g(福建吴氏实验动物有限公司提供，合格证号：FJWS2019-052)。

实验试剂：TSA、TSB购自广东环凯微生物科技有限公司；AG购自上海仝元生物科技有限公司；NAD购自上海克拉玛尔；小牛血清，购自上海江林生物科技有限公司；银杏提取物购自德国威玛舒培博士药厂(银杏提取物原液每毫升含银杏黄酮苷9.6 mg,萜内酯1.47 mg)；血液RNA、DNA反转录以及荧光定量检测试剂盒购自TAKARA生物公司；HPS抗体检测试剂盒购自北京飞凯生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 佐剂疫苗的制备

1.2.5 小鼠细胞因子的检测[9]

表1 副猪嗜血杆菌佐剂疫苗的制备

收集小鼠肝素钠抗凝外周血，取100 μL抗凝血裂解红细胞，洗涤并重悬细胞，用 BD FACS Calibur流式细胞仪检测 T淋巴细胞亚群 CD4+和CD8+比值变化，FlowJo7.6软件分析试验结果。

随机选取50只小鼠，设置5个实验组，每组小鼠10只，雌雄各半。分别为高、中、低浓度佐剂疫苗组、疫苗组和生理盐水对照组，一免皮下注射0.2 mL/只，14 d后以同样的途径和剂量进行二免。21 d后用HPS血清4型强毒株腹腔注射攻毒(1.2×109CFU·mL-1，0.5 mL/只)。记录小鼠临床表现，统计小鼠死亡率。

1.2.3 小鼠采血

同样的，我们仍用上文共享经济的定义尝试深究一下，元征此举是类似于滴滴打车和爱彼迎为交易服务提供两端链接的平台。滴滴打车链接了私家车主和乘客，爱彼迎链接了个人房东和有住宿需求的旅客，元征链接了汽修技师和车主，使得闲置的汽修技师的技术资源得到充分利用，给汽修技师和车主双方提供便利。而略有不同的是，滴滴打车和爱彼迎实现的是汽车、房屋等的共享，共享维修站除了场地和设备的共享，更具意义的是实现汽修技师技术的共享，同时解决了汽车维修这一服务对场地和设备的需求，从而使这一技术的共享得以落地实施。

分别在二免后第7 d和14 d小鼠眼眶采血，一部分于4000 r/min离心20 min后收集血清，2～8 ℃保存，用于IgG抗体的检测；另一部分用肝素锂抗凝处理，置于-70 ℃保存，用于细胞因子的检测。

1.2.4 小鼠副猪嗜血杆菌IgG抗体的检测相关操作参照试剂盒使用说明书进行。

将存于实验室的副猪嗜血杆菌血清4型菌株涂布于TSA培养基上复壮，37 ℃恒温培养24 h，挑取单菌落，接种于100 mL含5%(V/V)犊牛血清、4%(V/V)NAD的TSB液体培养基中，37 ℃180 r/min摇床培养过夜，再将种子液按1∶10(V/V)转接至含5%(V/V)犊牛血清、4%(V/V)NAD的TSB液体培养基中，37 ℃180 r/min摇床培养18 h，测OD600值，计算活菌含量；按菌液总体积加入0.5%甲醛置37 ℃摇床中灭活，24 h后取灭活菌液于TSA培养基划线培养，检验是否有细菌生长。灭活菌液用PBS调整浓度为1.33×1010CFU·mL-1，将菌液与不同浓度银杏叶黄酮苷混匀作为佐剂疫苗的水相(见表1)，白油与司班-80灭菌作为油相，水相和油相按比例(V∶V=1∶1.5)乳化，制备成油包水灭活苗，检验物理性状合格后，4 ℃保存备用。

我恨透了日本人。教会学校本来全是学英语、法语，日本人来了，非要我们学日语，教我们的老师就是日军翻译官，经常打我们。我一生只打过一次人。抗战胜利后，我邀了三个最要好的同学，在大街上对着迎面来的一个日本兵，走上去狠狠地搧了他个耳光。

1.2.6 外周血淋巴细胞亚群测定

表2 荧光定量PCR引物序列及退火温度

根据Genbank公布的小鼠细胞因子基因序列设计引物以及内参基因β-Actin的引物序列，由上海生工生物有限股份公司合成并提供。RNA的提取、cDNA的制备及Real-timePCR按说明书进行，扩增程序为：95 ℃预变性和变性30 s，60 ℃退火30 s，40个循环(见表2)。

1.2.2 小鼠的免疫及攻毒

1.2.7 数据分析

新的经济周期机制的税务策划、分析和规划将是一项税，一种缓慢的税收，所有企业在宏观控制、加强企业管理和全面统计，降低产品的成本，提高产品质量，使企业在市场竞争优势的优势。税收策划税收不同，根据法律规定，没有非法的问题。

一免后，银杏叶黄酮苷疫苗佐剂组IgG抗体水平均高于疫苗组，其中高浓度组IgG抗体水平显著高于疫苗组(P<0.01)；二免后，高浓度组IgG抗体水平低于疫苗组，低浓度组和中浓度组的IgG抗体水平显著高于疫苗组(P<0.01)(见图1)。

2 结果

2.1 攻毒小鼠情况

攻毒4 h后，小鼠开始出现焦躁、乱窜等现象；攻毒10 h后，小鼠精神沉郁，被毛湿乱，出现聚集、扎堆、厌食、倒翻和抽搐等现象；攻毒14 h后，未死亡的小鼠状态低迷，超过一半的小鼠死亡，疫苗组和生理盐水组死亡严重，其中生理盐水组小鼠全部死亡；攻毒48 h后，存活小鼠活跃度提升，采食、饮水等生理活动恢复正常。小鼠攻毒后保护率，低浓度组为80%，中浓度组为50%，高浓度组为30%，疫苗组为60%，生理盐水对照全部死亡(见表3)。

表3 小鼠副猪嗜血杆菌4型攻毒结果

2.2 小鼠IgG抗体检测水平结果

使用 SPSS 20.0 软件单因素方差分析和 LSD 法进行组间比较，当P<0.05时,差异被认为具统计学意义；使用2-△△Ct法[10-11]计算荧光定量PCR的基因表达，选择β-Actin为内参基因，计算公式为：△△CT=(CTTarget-CTβ-Actin)experimental -(CTTarge-CTβ-Actin)control。

注：与疫苗组相比，*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001，下同图1 小鼠血清IgG抗体水平

2.3 细胞因子的检测结果

对免疫后小鼠荧光定量PCR所得的CT值进行定量分析，结果表明：高、中、低三个浓度的银杏叶黄酮苷疫苗佐剂组对IL-4的表达具有显著促进作用(P<0.01)；低浓度组对TNF-α的表达有极显著作用(P<0.001)；高浓度组对INF-α的促进表达有显著作用(P<0.05)；疫苗组和生理盐水对照组对IL-4和TNF-α的表达无明显差异；添加银杏叶黄铜苷佐剂组对IL-2、IL-10和IFN-γ作用均不明显(P>0.05)(见图2)。

佐剂疫苗组、疫苗组CD4+和CD8+T淋巴细胞检测结果分别如图3A、B和C所示。结果显示，与未添加黄酮苷佐剂的疫苗组比较，添加低浓度黄酮苷佐剂显著升高小鼠外周血中CD4+T淋巴细胞比例(P<0.05)，添加银杏黄酮苷佐剂中浓度组和高浓度组较疫苗组略有升高，但差异不显著(图3A)；与疫苗组比较，添加低浓度黄酮苷佐剂虽可降低 CD8+T淋巴细胞的比例，但疫苗组和佐剂疫苗组之间差异不显著(图3D)；对小鼠外周血CD4+/CD8+T淋巴细胞的比值，低浓度黄酮苷佐剂疫苗组和高浓度黄酮苷佐剂疫苗组显著升高(P<0.05)，表明银杏叶黄酮苷可刺激机体淋巴细胞的分化(见图3E)。

图2 小鼠外周血细胞因子的基因表达量

2.4 T淋巴细胞亚群的检测

笔者不惮篇幅，引用其说，意在彰明石涛论中国画创作整体性的“曲折”逻辑:笔墨→氤氲→混沌→一画(实为笔墨)→自我→笔墨→胎一(即混沌)→氤氲→笔墨，由此进入到创造的循环之中。此段批评，实际上是论说了笔墨与氤氲、笔墨与自我、笔墨与混沌三种关系，但石涛并未以今天常见的批评方式，分而论之，而是以线性回文的三个回环，来曲折言说。于此，正鲜活现出积淀在中国艺术家、批评家心灵与思维深处的“曲折感”。

A B C

3 分析与讨论

银杏叶黄酮苷对单核巨噬细胞具免疫促进作用。覃红斌[10]、VILLASENOR等[11]报道，银杏叶黄酮苷能提高大鼠、小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力。本实验中，添加不同浓度的黄酮苷佐剂对小鼠均有保护作用，以低浓度添加量保护率最好。

体液免疫是B细胞介导的一种重要的免疫反应，血清中抗体水平为评估其免疫状况的重要指标之一。银杏叶黄酮苷能促进抗体的生成，增强机体的体液免疫功能[12]。明亮等[13]试验证明，银杏黄酮提取物能明显提高环磷酰胺引起的免疫功能低下的小鼠血清IgG水平。本次实验，一免后，银杏叶黄酮苷疫苗佐剂组IgG抗体水平均高于疫苗组，其中高浓度组IgG抗体水平显著高于疫苗组(P<0.01)；二免后，低浓度组和中浓度组的IgG抗体水平仍显著升高，但高浓度组IgG抗体水平显著降低，IgG抗体水平低于疫苗组。王蕙等[14]试验发现，银杏黄酮对体外淋巴细胞增殖的影响具有剂量依赖性，但当浓度过高对淋巴细胞增殖有明显抑制作用。高浓度银杏黄酮苷对小鼠体液免疫应答是否也具抑制作用，有待进一步研究。

（3）设计仅考虑最大负荷工况，未结合长期运行过程中的实际生产负荷，变工况状态下机组与循环泵系统的调节措施欠缺；

细胞因子(cytokine，CK)是外界病原体刺激免疫系统时诱导免疫细胞分泌参与机体免疫调节的一种小分子量蛋白质，通过协同、拮抗等多种生理特性抵抗病原体的入侵，消灭机体有害病原体，不同的细胞分泌不同的细胞因子且行使着不同的功能职责，调节参与机体的免疫作用，维持体内的正常的生理稳态平衡。IL-4是辅助性T细胞(TH细胞)在识别抗原过程中产生的重要的细胞因子，对淋巴细胞的活化、生长和分化具有重要的调节作用。IL-4是TH2分泌的细胞因子，对B细胞活化具有重要作用。王国栋等[15]研究表明，银杏叶提取物能调节机体LPS的数量，LPS可诱导KC细胞表达TNF-α，当银杏叶提取物浓度增加时，合成TNF-α的mRNA和相应的蛋白质表达被抑制，从而抑制KC细胞释放过量的TNF-α，达到抗炎的效果。张素英等[16]将银杏叶提取物连续12周灌胃糖尿病模型实验鼠发现，肾组织中的IL-6以及TNF-α等炎症因子明显升高，进而改善糖尿病模型实验鼠的肾功能，降低了DN的发生率，本次实验结果，细胞因子分泌量只有IL-4和TNF-α的有明显的变化，低浓度组的佐剂疫苗明显能促进IL-4和TNF-α的表达(P<0.01)，中、高浓度组对IL-4的表达也有促进(P<0.05)；高浓度组也能促进TNF-a的表达，但差异不明显。

CD4+/CD8+比值是判断机体免疫功能状态的重要指标，正常小鼠CD4+/CD8+比值为1～2[16-18]。对小鼠外周血T淋巴细胞亚群的检测结果标明，添加低浓度黄酮苷佐剂能显著升高小鼠外周血中CD4+T淋巴细胞比例(P<0.05)，对小鼠外周血CD4+/CD8+T淋巴细胞的比值，低浓度黄酮苷佐剂疫苗组和高浓度黄酮苷佐剂疫苗组显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01)，表明银杏叶黄酮苷可刺激机体淋巴细胞的分化。

综上所述，利拉鲁肽联合胰岛素治疗肥胖T2DM是安全有效的，可显著控制血糖、血脂，改善胰岛功能，值得临床应用推广。

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银杏叶黄酮苷提取物的药用价值广泛。在营养饲料上，李焰等[19]研究发现，添加不同剂量的银杏叶黄酮苷提取物与肉鸡饲粮混合饲喂肉鸡，均能提高肉鸡的日增重；添加0.20%的银杏叶黄酮苷提取物可降低盲肠中21.99%的大肠杆菌数量；添加0.25%的银杏叶黄酮苷提取物，能使盲肠中乳酸菌数量提高7.74%，粗蛋白利用率提高7.14%。黄其春等[20-21]在仔猪日粮中添加质量分数0.2%和0.3%的银杏叶黄酮苷提取物,能够增强断奶仔猪的体液免疫功能，改善断奶仔猪血清生化指标,提高生长相关激素水平,促进仔猪生长。银杏叶黄酮苷作为疫苗佐剂的研究目前未见报道。本实验结果，在副猪嗜血杆菌4型灭活疫苗中添加低浓度银杏叶黄酮苷能显著提高小鼠机体内IgG抗体水平，促进诱导细胞免疫和体液免疫反应。综上，本试验表明，银杏叶黄酮苷具有一定的免疫佐剂效果，但其在猪的免疫效果还需进一步试验研究。