甲基营养型芽胞杆菌BMF 04固态发酵条件优化及其对黄瓜幼苗生长的影响

陈新元，陈 茹，吴海霞，马桂珍，暴增海

（江苏海洋大学海洋科学与水产学院，连云港 222005）

甲基营养型芽胞杆菌Bacillusmethyltrophicus是2010年报道的新种[1]，因其代谢产物的多样性、对外界环境因子的多抗逆性和无污染无毒害等优点，被越来越多地运用于农业领域[2-5]。许多学者从不同环境中分离得到多个对多种植物病害具有良好的防治效果并具有促生作用的甲基营养型芽胞杆菌。采俊香和李月梅[6]从抱紧苦荬菜根部分离到对番茄早疫病病菌Alternariasolani等植物病原菌具有较好抑菌效果的甲基营养型芽胞杆菌 G-5。殷晓敏等[7]和谢学文等[8]分别从西瓜和黄瓜的根际土壤分离获得对西瓜枯萎病菌Fusariumoxysporum和黄瓜炭疽病菌Colletotrichumlagenarium具有良好防治作用的甲基营养型芽胞杆菌XG-1和WF-3。黎肇家等[9]从黄柏树皮分离到一株对黄柏苗有显著促生效果的甲基营养型芽胞杆菌T50。一些菌株目前已经被开发成微生物制剂，用于植物病害的防治[10]；谢学文等[11]和胡江春等[12]把从黄瓜根际土壤和海泥中得到的两株甲基营养型芽胞杆菌WF-3和9912分别研制成了微粉剂和可湿性粉剂，用于黄瓜炭疽病和黄瓜灰霉病的防治，具有较好的防治效果。

目前，有关芽胞杆菌大量制备的方法多为液态发酵，与液态发酵相比，固态发酵具有培养基原料来源广且价格低、能耗少、技术较简单、产物的产率较高、环境污染较小等优点，在微生物肥料、微生物农药以及饲料的生产中使用愈加广泛[8,13]。如唐晓星等[14]利用甲基营养型芽胞杆菌NCU507固态发酵豆粕获得蛋白酶，潘韵等[15]利用甲基营养型芽胞杆菌2-3固态发酵生产鸡饲料等，而有关甲基营养型芽胞杆菌生防菌株固态发酵培养基及其发酵条件研究较少。

本实验室前期从连云港海域中分离得到一株对苹果腐烂病菌ValsamaliMiyableetYamada、小麦赤霉病菌Fusariumgraminearum、番茄早疫病菌、稻瘟病病菌Pyriculariaoryzae等多种植物病原真菌有良好的抑制作用的甲基营养型芽胞杆菌BMF 04，为充分利用农产品下脚料，降低生产成本，提高生产效率，进一步开发利用菌株研制微生物制剂，采用单因素和响应面试验设计，优化该菌株的固态发酵培养基配方和发酵条件，通过室内盆栽试验测定发酵物对黄瓜幼苗生长的影响，为该菌株的开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 甲基营养型芽胞杆菌BMF 04由本实验室在连云港海域中分离并保存。

1.1.2 培养基 菌株活化培养基为PDA培养基；种子液培养基为PD培养基。

1.2 种子液的制备

菌株BMF 04活化后接种于装有60 mL PD培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min振荡培养16 h，调整菌液浓度为108细胞/mL，作为发酵种子液。

1.3 固态发酵初始条件

250 mL三角瓶装瓶量20%，接种量为培养基质量的20%，pH自然，发酵温度37 ℃，发酵时间3 d。

1.4 细菌总数和芽胞率的测定

不同位置的菌株BMF 04发酵物混合均匀后，随机取10 g加入到装有90 mL含有0.5%吐温-80的无菌水溶液和10个直径为0.5 cm的玻璃珠的250 mL三角瓶中，180 r/min充分振荡30 min为菌悬液，菌悬液梯度稀释，采用血球计数板法[16]测定稀释液中的细菌总数，采用结晶紫染色法[17]测定芽胞率。

1.5 菌株BMF 04固态发酵培养基的优化

1.5.1 基础培养基筛选 将菌株BMF 04分别接种到8种不同的培养基（表1）中，按1.3条件进行发酵，测定不同培养基发酵物中的细菌总数和芽胞率，选择细菌总数和芽胞率高的培养基作为优化的基础培养基。每种培养基为一个处理，每个处理接种3瓶为3次重复。

表1 不同固态发酵培养基的配方Table 1 Formulation of different solid-state fermentation media

1.5.2 培养基优化的单因素试验 选择蔗糖、淀粉、麸皮、玉米粉、葡萄糖、玉米芯、菌糠、稻壳粉、米糠分别代替基础培养基中的碳源；按1%质量比在培养基中分别加入尿素、硫酸铵、硝酸铵、氯化氨、硝酸钠为补充氮源；按0.1%质量比在基础培养基中分别加入硫酸镁、碳酸钙、氯化钠、磷酸氢二钾、硫酸锰、硫酸锌、硫酸亚铁为补充无机盐；每一因素变化时其他成分及含量固定不变，配制不同发酵培养基，在基础发酵条件下进行发酵，每种培养基为一处理，每处理接种3瓶，为3次重复，以基础培养基为对照，测定不同培养基发酵物中的细菌总数和芽胞率，筛选细菌总数和芽胞率高的碳源、氮源和无机盐种类。

将筛选出的碳源按培养基质量2%、4%、6%、8%、10%；氮源按培养基质量0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2%；无机盐按培养基质量0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，分别加入到基础培养基中，每种因素试验其他成分及含量固定不变，以基础培养基为对照，在基础发酵条件下发酵，每个变量为一个处理，每个处理接种3瓶为3次重复，测定不同质量比碳源、氮源和无机盐发酵物的细菌总数和芽胞率，确定碳源、氮源、无机盐的添加质量比。

1.5.3 培养基优化的响应面试验 以单因素试验筛选出的培养基碳源、氮源、无机盐种类和浓度为基础，通过Design-Expert 8.0.6软件，利用Box-Behnken设计原理，以细菌总数为响应值，以碳源含量（A）、氮源含量（B）、无机盐含量（C）为自变量，进行响应面试验，测定不同组合发酵物中BMF 04菌株的细菌总数和芽胞率，分析不同因素和水平对菌株BMF 04固态发酵的影响及其显著性。

1.6 菌株BMF 04固态发酵条件的优化

以优化后的培养基为发酵培养基，对BMF 04菌株的发酵时间、温度、料水比、接种量、初始pH等发酵条件进行优化。发酵时间优化在1.3初始条件下发酵，接种后每4 h取样一次，测定确定最佳发酵时间；发酵温度设为 24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃、40 ℃；料水比设为 1:0.7、1:1、1:1.3:、1:1.6、1:1.9；接种量设为质量比5%、10%、15%、20%、25%；不同初始pH设为5、6、7、8、9，以初始发酵条件为基础，每一因素的优化均在前一因素优化的基础上进行，测定不同条件下发酵物中的细菌总数及芽胞率。每个发酵条件为一处理，每个处理3次重复。

1.7 优化后培养基配方和发酵条件的细菌总数和芽胞产率

将菌株BMF 04分别接种到基础培养基和优化后的培养基中，分别按优化前和优化后的条件进行发酵，比较优化前后发酵物中的细菌总数和芽胞率。

1.8 菌株BMF 04固态发酵物对黄瓜幼苗生长的影响

1.8.1 黄瓜种子处理 黄瓜品种为新津研四号，购于连云港市种子站。用温汤浸种法对黄瓜种子进行消毒，取出种子置于垫有两层湿润滤纸片的培养皿中，28 ℃条件下恒温催芽1 d至种子露白。

1.8.2 土壤处理与播种 将发酵物与土壤分别按照质量比 1:100、1:150、1:200、1:250、1:300混匀，装入25 cm×14 cm的花盆中（每盆1.5 kg），以空白土壤为对照，每盆播种15粒催芽后的黄瓜种子，每个比例为一处理，每个处理播种4盆。分别于子叶期、一叶期、二叶期、三叶期随机取5株幼苗，测定黄瓜株高和茎粗，于三叶期时测定幼苗地上部分与地下部分的鲜重和干重以及须根数。

1.9 数据统计与分析

采用SPSS 19.0软件分析处理，响应面设计及数据分析由Design-Expert 8.0.6软件完成。

2 结果与分析

2.1 菌株BMF 04固态发酵培养基优化

2.1.1 基础培养基筛选 菌株BMF 04在供试的不同基础培养基中细菌总数和芽胞率不同，在培养基1中的细菌总数最高，为2.65×1010细胞/g；而培养基5的芽胞率最高，可达93%。但培养基5的细菌总数为2.47×1010细胞/g，显著低于培养基1（P＜0.05）。因此，选择培养基1作为BMF 04菌株固态发酵培养基优化的基础培养基（图1）。

图1 菌株BMF 04在不同固态发酵培养基中的发酵情况Fig.1 Fermentation of BMF 04 in different solid-state fermentation media

2.1.2 最佳碳源种类及含量的确定 不同碳源对菌株BMF 04细菌总数和芽胞率有显著影响。以菌糠和玉米粉作为碳源的发酵物中的细菌总数最高，分别为2.76×1010细胞/g和 2.69×1010细胞/g，二者差异不显著（P＞0.05），芽胞率分别为92%和96%（图2）。考虑到菌糠成本低于玉米粉，选择菌糠为BMF 04菌株固态发酵培养基的碳源。碳源浓度试验显示，菌糠含量为8%时，发酵物中的细菌总数最高，为 2.94×1010细胞/g，与其他处理差异显著（P＜0.05），芽胞率为93%；菌糠的浓度低于或高于8%，细菌总数均显著下降。因此，选择菌糠含量为8%作为响应面试验中间值（图3）。

图2 不同碳源对菌株BMF 04固态发酵细菌总量和芽胞产率的影响Fig.2 Effect of different carbon sources on solid state fermentation of BMF 04 strain

图3 碳源浓度对菌株BMF 04固态发酵细菌总量和芽胞产率的影响Fig.3 Effect of carbon source concentration on solid state fermentation of BMF 04 strain

2.1.3 最佳氮源种类及含量的确定 以硝酸铵为氮源的发酵物中细菌总数最高，为2.66×1010细胞/g，显著高于其他氮源（P＜0.05），芽胞率为89.3%，因此选择硝酸铵作为BMF 04菌株固态发酵培养基的氮源（图4）；氮源浓度试验显示，硝酸铵含量为 0.8%时，发酵物中细菌总数最高，为 2.77×1010细胞/g，与其他处理差异显著（P＜0.05），且芽胞率较高，为85%；硝酸铵含量低于或高于0.8%时，细菌总数显著降低（P＜0.05），因此，将氮源含量0.8%作为响应面试验的中间值（图5）。

图4 不同氮源对菌株BMF 04固态发酵细菌总量和芽胞产率的影响Fig.4 Effect of different nitrogen sources on solid state fermentation of BMF 04 strain

图5 氮源浓度对菌株BMF 04固态发酵细菌总量和芽胞产率的影响Fig.5 Effect of nitrogen source concentration on solid state fermentation of BMF 04 strain

2.1.4 最佳无机盐种类及含量的确定 在培养基中分别加入0.1%的不同种类无机盐，发酵物中细菌总数和芽胞率明显不同。添加碳酸钙和氯化钠发酵物中的细菌总数显著高于其他无机盐，分别为2.75×1010细胞/g和2.74×1010细胞/g，二者差异不显著（P＞0.05），但添加氯化钠的发酵物中的芽胞率较高，为87%，因此选择氯化钠为培养基的无机盐（图6）；氯化钠含量试验显示，氯化钠含量为0.2%时，发酵物中细菌总数显著高于其他含量，为2.98×1010细胞/g，且芽胞率较高，为84%；氯化钠浓度高于或低于0.2%，细菌总数均显著降低，因此将氯化钠含量0.2%作为响应面试验的中间值（图7）。

图6 不同无机盐对菌株BMF 04固态发酵细菌总量和芽胞产率的影响Fig.6 Effect of different inorganic salts on solid state fermentation of strain BMF 04

2.1.5 培养基优化响应面试验结果分析 使用Design-Expert 8.0.6软件对17组试验结果进行分析，对表中数据进行多元回归拟合，得到A、B、C因素与细菌总数Y之间的模型回归方程为Y=-1.42＋0.46A＋6.86B＋10.22C-0.09AB-0.03AC＋0.25BC-0.03A2-4.98B2-25.68C2。

回归模型的P＜0.0001，失拟项的P值为0.55，模型回归极显著，失拟检验不显著，说明未知因素对试验结果干扰较小，模型稳定。回归方程的决定系数R2=0.9890，说明该方程与实际情况拟合较好。不同因素对细菌总数的影响大小不同，氮源＞碳源＞无机盐，碳源与氮源浓度两因素之间的交互作用较为显著。推测出的极值点为菌糠6.7%，硝酸铵0.6%，氯化钠0.2%，细菌总数预测值为3.27×1010细胞/g（表2）。

表2 菌株BMF 04培养基优化响应面设计及试验结果Table 2 Response surface design and test results of culture medium optimization of strain BMF 04

为验证响应面试验的可靠性，采用1.3的发酵条件进行验证试验，按照优化后的培养基做3组平行试验，测得发酵物中细菌总数为3.31×1010细胞/g，芽胞率为90%，与预计值3.27×1010细胞/g差异不显著（P＜0.05），试验结果与模型预测拟合性较好，说明此优化结果有效，得到的优化组合可作为菌株固体发酵的最优培养基（表3）。

表3 回归方程的方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

2.2 菌株BMF 04固态发酵条件优化

2.2.1 发酵时间对固态发酵的影响 在8～44 h时，细菌总数快速增加，44 h时细菌总数为3.4×1010细胞/g为对数期，其后细菌总数增加缓慢，进入稳定期，72 h细菌总数开始下降为3.32×1010细胞/g，进入衰退期。36 h时开始形成芽胞，44 h芽胞率快速提高，44～68 h时芽胞率由3%增长至92%，因此认为甲基营养型芽胞杆菌BMF 04固态发酵的时间为68 h（图8）。

图8 菌株BMF 04固态发酵的时效曲线Fig.8 Time effect curve of solid state fermentation of strain BMF 04

2.2.2 发酵温度对固态发酵的影响 发酵温度对菌株BMF 04细胞总数和芽胞率有明显影响，温度为32 ℃时，细菌总数最高，为4.16×1010细胞/g，显著高于其他处理（P＜0.05），温度高于或低于32 ℃时，细菌总数明显下降。温度对芽胞率影响较小，温度高于 28 ℃时，芽胞率变化较小，因此选择 32 ℃作为菌株BMF 04固态发酵温度（图9）。

图9 发酵温度对菌株BMF 04固态发酵细菌总量和芽胞产率的影响Fig.9 Effect of fermentation temperature on solid state fermentation of strain BMF 04

2.2.3 料水比对固态发酵的影响 当料水比为1:1时，细菌总数显著高于其他处理（P＜0.05），为4.13×1010细胞/g，芽胞率为89.7%，料水比低于或高于1:1时，细菌总数均显著下降。因此，菌株BMF 04固态发酵培养基料水比为1:1（图10）。

图10 料水比对菌株BMF 04固态发酵细菌总量和芽胞产率的影响Fig.10 Effect of feed water ratio on solid state fermentation of strain BMF 04

2.2.4 接种量对固态发酵的影响 试验结果表明，接种量对菌株BMF 04固态发酵的细菌总数有显著影响。接种量为15%时，细菌总数显著高于其他处理，为4.88×1010细胞/g；接种量低于15%时，芽胞率显著低于其他处理，因此，选择15%作为BMF 04菌株固态发酵最佳接种量（图11）。

图11 接种量对菌株BMF 04固态发酵细菌总量和芽胞产率的影响Fig.11 Effect of inoculation amount on solid state fermentation of strain BMF 04

2.2.5 初始pH值对固态发酵的影响 试验结果表明，pH对菌株BMF 04细菌总数影响明显，不同pH时发酵物中细菌总数差异显著，而对芽胞率影响较小。pH值为7时，发酵物中的细菌总数最高，为6.62×1010细胞/g，芽胞率为91.7%，pH高于7或低于7时细菌总数均显著减少（图12）。因此，BMF 04菌株固态发酵培养基初始pH为7。

图12 初始pH值对菌株BMF 04固态发酵细菌总量和芽胞产率的影响Fig.12 Effect of initial pH value on solid state fermentation of BMF 04 strain

2.3 优化后培养基配方和发酵条件的细菌总数和芽胞产率确认

菌株BMF 04同时按优化前和优化后的条件进行固态发酵，优化后细菌总数为6.61×1010细胞/g，是优化前的细菌总数的2.5倍，芽胞率达90.7%。

2.4 菌株BMF 04固态发酵物对黄瓜幼苗生长的影响

菌株BMF 04固态发酵物对黄瓜幼苗的株高、茎粗、地上部和下部鲜重以及须根数有明显影响，发酵物与土壤的比例不同，影响大小不同。质量比为1:250时，黄瓜幼苗株高为（100.13±3.15）mm，较CK提高39%；地上鲜重为（4.77±0.21）g，较CK提高50%，茎粗与须根数较CK均有显著增加（P＜0.05）（表4）。

表4 菌株BMF 04固态发酵物对黄瓜幼苗生长影响Table 4 Effect of solid fermentation of BMF 04 strain on cucumber seedling growth

3 讨论

为了提高生防甲基营养型芽胞杆菌BMF 04发酵细菌总数与芽胞率，提高试验效率，降低生产成本，本研究在单因素试验基础上，采用响应面优化法优化培养基配方[18]。结果表明，甲基营养型芽胞杆菌BMF 04固态发酵发酵最佳培养基配方为：豆粕92.5%，菌糠6.7%，硝酸铵0.6%，氯化钠0.2%。通过单因素试验筛选出甲基营养型芽胞杆菌BMF 04最佳发酵条件为：pH 7，料水比1:1，温度32 ℃，培养时间68 h，接种量为15%（种子液浓度为108细胞/mL），在此条件下，发酵物的细菌总数达6.61×1010细胞/g，芽胞率达到90.7%。

优化后的培养基中主要成分为豆粕，该发酵基质不易结块，有利于菌株的生长繁殖[19,20]。添加蔗糖和葡萄糖BMF 04的细菌总数明显低于对照，秦宇轩等[21]研究结果表明，蔗糖和葡萄糖具有高渗透压，导致培养环境不利于细胞生长，引起微生物细胞脱水[22]；添加菌糠、玉米粉和米糠细菌总数较高，可能是由于这些物质中除了含有菌株生长所需的碳源外还含有其他营养物质，如菌糠除含有大量的纤维素与半纤维素外，还含有丰富的食用菌菌体蛋白，能够为菌株生长提供营养[23]。

细菌的生长繁殖和芽胞的形成受到无机盐、培养温度、pH等因素的影响[24-26]，本研究结果认为BMF 04的发酵适温为32 ℃，明显低于唐晓星等[14]研究的甲基营养型芽胞杆菌NCU507固态发酵最佳温度40 ℃，发酵温度越低，发酵耗能低，利于降低发酵成本，便于该菌株的开发应用；发酵时间相比于李玉洋等[24]报道的多粘类芽胞杆菌SH15最佳发酵时间144 h明显缩短；本研究接种量为15%，远低于王卉等[27]研究的解淀粉芽胞杆菌L-S60 30%的接种量。熊涛等[28]的研究认为甲基营养型芽胞杆菌B-1固态发酵最佳pH为7，与本研究结果初始pH 7相一致。

芽胞杆菌作为重要的生防资源，促生防病作用显著，在植物病害防治上应用广泛。赵卫松等[29]报道解淀粉芽胞杆菌PHODB35对番茄幼苗有明显的促生作用，施用菌株后对株高、地上鲜重分别增加28.21%和22.59%；徐瑛等[30]报道解淀粉芽胞杆菌GB03对藜麦生长有促进作用，GB03处理的藜麦根长与对照相比提高31.19%，茎长与对照相比提高6.26%。本试验利用甲基营养型芽胞杆菌BMF 04固态发酵物与土壤以1:250质量比混合施用，黄瓜幼苗株高和根长显著高于对照（P＜0.05），增长率分别为39%和50%，对黄瓜幼苗具有显著的促生作用，具有广阔的开发应用前景。

与化学药剂和化学肥料相比，利用生防菌株研制生防菌剂具有无污染、对生态环境影响小等优点，已成为植物病害防治的研究热点，极具发展潜力。目前，本试验仅对甲基营养型芽胞杆菌BMF 04固态发酵培养基和发酵条件进行优化以及室内对黄瓜的促生方面的进行了研究，有关于相关菌株的制剂开发和田间应用效果有待进一步研究。