氮及氮素形态对烤烟叶片叶绿素光合荧光参数的影响

黄 丹 杨富文 刘 琳 王 月 贺国强 王洪瑞 孙广玉 敖 红

（1东北林业大学生命科学学院，150040，黑龙江哈尔滨；2牡丹江烟草科学研究所，150076，黑龙江哈尔滨）

烤烟与晾晒烟、白肋烟、香料烟、雪茄烟和黄花烟均为我国烟草（Nicotiana tabacum L.）的主要类型，由于各地区的土壤栽培条件、制烟工艺及烟草实际生产情况等存在差异，导致我国南北地区栽培的烟草类型不同[1-2]。黑龙江省是我国重要的烤烟产区，近年来选育出了高产优质的烤烟新品种。龙江911是黑龙江省2000年通过审定的烤烟品种，是东北地区主要烤烟品种之一，具有烟叶质量上乘、产量较高、抗病性强且较为耐旱的特点[3-4]。龙江0520是2017年黑龙江省烟草专卖局选育并通过全国农业评审的烤烟品种，在长势以及产量等方面均有突出表现。烟草品种在不良环境因素条件下的适应性、生长速度与状态、营养物质的积累及烟叶的品质与产量等方面存在一定差异，因此选择与推广更适合东北地区种植的烤烟品种仍需进一步探究。

氮素是植物生长过程中必不可少的一种营养元素，是组成蛋白质、核酸和叶绿素等的基本元素，通过参与复杂的生理过程来调节植物的生长发育[5-6]。施氮会影响多种植物的光合能力[7-8]。李小龙[9]研究发现，不同氮素形态及配比对蔬菜叶片光合气体交换参数有直接影响；叶义全等[10]发现，NH4+-N处理下杉木幼苗叶片净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）和蒸腾速率（Tr）明显高于其他氮素形态处理；金微微等[11]在桑树对不同氮素形态响应的研究中发现，NO3--N处理下主要的光合气体交换参数和叶绿素荧光参数高于NH4+-N处理。对于烤烟而言，氮素营养的供应尤为关键，其对烤烟的影响是多方面的。黄化刚等[12]研究发现，施用有机氮肥有利于烤烟碳氮代谢途径关键基因的表达，从而促进上部烟叶总糖和烟碱含量增加；李得瑞等[13]研究表明，随着硝铵比的提高，烟草中硝酸还原酶和钾含量等都呈现先升高后降低的趋势；另外改变氮素形态及其配比会直接影响烤烟叶片光合作用碳代谢的协调程度、矿质元素的吸收和营养物质的积累等，从而进一步影响烤烟的生长发育及产量品质等方面[14-17]。尽管目前关于氮素对烤烟光合作用的影响有所研究，但从气体交换参数与叶绿素荧光特性这两方面研究烤烟在不同氮素形态下的相关表现不多，特别是氮素形态对光合系统Ⅱ（PSⅡ）功能的影响未见报道。因此本研究以具有表征特性的光合气体参数以及具有本质特征的快速叶绿素荧光动力学曲线（OJIP曲线）来探究不同氮素形态对烤烟光合作用和PSⅡ中光能吸收、转化、传递及分配的影响，以期为不同烤烟品种氮肥的合理施用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验地点

供试烤烟品种龙江911（LJ911）和龙江0520（LJ0520）均由牡丹江烟草科学研究所提供。于2019年4月初在中国烟草总公司黑龙江省公司烟草科学研究所宾西试验场温室内进行常规漂浮育苗[18]，幼苗长至5叶1心期时，将其移栽至东北林业大学植物生理实验室。

1.2 试验设计与指标测定

1.2.1 试验设计 试验设置4组处理（表1），分别为无氮Hoagland营养液（对照，CK）、只含有硝态氮氮源（NO3--N）营养液（T1）、只含有铵态氮氮源（NH4+-N）营养液（T2）和硝态氮与铵态氮氮源比例为1∶1（NO3--N∶NH4+-N=1∶1）营养液（T3）。挑选长势一致的完整幼苗移栽，每钵定植1株，营养钵直径12cm，高14cm，将营养钵放入容积为10L的营养盒中，向营养盒中分别加入2L各处理的营养液，营养液每隔3d更换1次。每个处理均设3个重复，分别于培养后第15天（5月25日）和第30天（6月9日）选取同一叶片进行光合气体参数和叶绿素荧光参数的测定。

表1 不同处理硝态氮与铵态氮营养液主要成分比例及摩尔数Table 1 Principal component ratio and number of moles of nitrate nitrogen and ammonium nitrogen nutrient solution under different treatments mmol/L

1.2.2 气体交换参数的测定 选择长势基本一致的烟草样品，利用Li-6400光合仪测定气体交换参数。选择天气晴朗的上午进行测定，待测烟草植株在自然光条件下先诱导1.0～1.5h。光合测定系统的光强设定为1 000μmol/（m2·s）、流量500μmol/s、温度20℃，并利用缓冲桶装置来维持CO2浓度的稳定性。选择从顶部向下数第3片完全展开的功能叶片进行测定，测定指标包括叶片的Pn、Tr、胞间CO2浓度（Ci）和Gs等。

1.2.3 荧光动力学曲线的测定 于气体交换参数测定的同一时期利用便携式脉冲调制荧光仪M-PEA测定样品同一叶片的叶绿素荧光参数。选择待测叶片第3与第4叶脉之间（以叶基部数为起始），并与主叶脉距离约2cm处的位置作为测定部位，使用荧光仪配备的专用暗适应叶夹进行30min的暗适应。测定得到的数据包括初始荧光（Fo）、最大荧光（Fm）、PSⅡ的最大光化学效率（Fv/Fm）及光合性能指数（PIabs）。

OJIP曲线的测定需利用脉冲红光进行诱导，其光强为3 000μmol/（m2·s）。相对荧光强度（Fv）的起始记录时间从10μs开始，至结束共记录1s。记录过程中时间轴为0.02、2、30以及1 000ms，在曲线中对应的点分别称为O、J、I和P，其对应的荧光强度分别用FO、FJ、FI和FP表示，取记录中10次重复的平均值绘制OJIP曲线。时间轴中0.15与0.30ms在曲线上对应的特征点分别为L点与K点，其代表的相对荧光强度分别用FL和FK表示。进一步研究2个烤烟品种在不同处理OJIP曲线的特异性，需进行O-P、O-J和O-K的标准化。设O点对应的相对荧光强度（FO）为0，将P、J、K点对应的相对荧光强度定义为1，Ft为不同时间点的相对荧光强度，可以得到VO-P=（Ft-FO）/（FP-FO）、VO-J=（Ft-FO）/（FJ-FO）、（Ft-FO）、VO-K=（Ft-FO）/（FK-FO）。在标准化曲线中特征点L、K、J和I对应的相对可变荧光强度分别用VL、VK、VJ和VI表示。将2个品种不同处理的VO-P、VO-J、VO-K与各自的CK作差值，分别以ΔVO-P、ΔVO-J、ΔVO-K表示。

1.2.4 数据处理与统计学分析 用Excel 2013、SPSS 19.0及SigmaPlot 12.5进行数据统计与分析，采用Duncan法进行多重比较，显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 不同氮素形态对烤烟叶片光合气体交换参数的影响

2.1.1 对Pn和Ci的影响 由表2可见，不同施氮处理的Pn均大于CK，且差异显著，而不同形态的氮素处理间也存在显著差异（P＜0.05）。LJ911测定的Pn均为T1处理最高，2次的测定值分别为9.61和12.15μmol/（m2·s），与CK相比分别提高46.62%和83.21%。LJ0520在T3处理中Pn最大，分别为11.36和11.82μmol/（m2·s），较CK分别高出78.17%和96.16%。对2次的测定结果比较可以看出，施氮组第2次测定时Pn的提高幅度要大于第1次。

表2 不同氮素形态对两种烤烟叶片光合气体参数的影响Table 2 Effects of different nitrogen forms on photosynthetic gas parameters of leaves of two flue-cured tobacco varieties

不同施氮处理Ci在品种间及在2次测定中表现出的特点不同，处理15d时LJ911 T2处理显著低于T1处理；LJ0520在T2处理下Ci高于其他处理组。处理30d时LJ911在T2处理下较CK高15.47%；LJ0520在T2和T3处理下分别较CK低23.02%和11.96%。

2.1.2 对Tr和Gs的影响 在不同处理中2个品种Tr及Gs表现出的特征基本上与Pn一致。第1次测定中，LJ911在T1处理下Tr和Gs均大于其他处理，分别较CK提高45.44%和67.74%；LJ0520在T3处理中Tr和Gs均大于其他处理，分别较CK提高86.97%和91.67%。第2次测定中，LJ911的Tr在T3处理下较大，Gs在T1处理下最大，较CK高81.56%；LJ0520在T3处理中Tr和Gs均大于其他处理，分别较CK提高95.32%和96.43%（表2）。

2.2 不同氮素形态对烤烟叶片荧光动力学曲线的影响

2.2.1 不同氮素形态对烤烟叶片OJIP曲线的影响LJ911和LJ0520在不同氮素形态下叶片OJIP曲线表现出不同特点，随着培养时间的增加，2个烤烟品种在各处理中叶片OJIP曲线也在不断变化。

从图1可以看出，处理15d时，2个烤烟品种OJIP曲线的变化趋势与规律大致相同，均表现为在T1处理中的荧光强度显著高于CK，但品种间差异不显著；LJ0520在T2处理中的荧光强度显著高于CK，而LJ911在T2处理中的荧光强度低于CK，LJ0520的FP比LJ911高93.55%，且差异显著（P＜0.05）；LJ911在T3处理中的荧光强度显著高于CK，而LJ0520在T3处理中的荧光强度低于CK，LJ911的FP比LJ0520高93.31%，且差异显著（P＜0.05）。

图1 不同氮素形态对2个烤烟品种叶片OJIP曲线的影响Fig.1 Effects of different nitrogen forms on OJIP curves of leaves of two flue-cured tobacco varieties

与处理15d时相比，处理30d时2个品种不同氮素处理下荧光强度总体表现为下降趋势。比较FP的测定结果，LJ911在T1及T3处理下的下降幅度较大，分别下降了48.80%和52.06%，LJ0520在T2处理下的下降幅度较大，为49.35%。

2.2.2 不同氮素形态对烤烟叶片标准化J点和I点相对可变荧光强度的影响 将OJIP曲线进行标准化处理（图2），处理15d时施氮处理的2个烤烟品种I点总体呈下降趋势，且T1处理LJ911的VI比CK降低9.89%，T1及T2处理LJ0520的VI比CK分别降低7.19%和4.61%，差异均显著（P＜0.05）。

图2 不同氮素形态对2个烤烟品种叶片标准化J点和I点相对可变荧光强度的影响Fig.2 Effects of different nitrogen forms on the relative variable fluorescence intensity of standardized J and I points in two flue-cured tobacco leaves

处理30d时，LJ911施氮处理组VI均低于CK，且差异显著（P＜0.05）；2个烤烟品种的J点总体亦呈下降趋势，且T1及T3处理LJ911的VJ分别比CK低29.65%和36.76%，差异均显著（P＜0.05），T1、T2及T3处理LJ0520的VJ分别比CK低29.74%、13.53%和37.92%，差异均显著（P＜0.05）。

综合分析测定结果可以看出，在2次测定过程中2个品种在不同处理下相对可变荧光强度的变化趋势基本一致，而在同一氮素处理下2个品种间VJ和VI均未表现出显著的差异。

2.2.3 不同氮素形态对烤烟叶片PSⅡ光化学活性的影响 从图3可以看出，2个烤烟品种在不同氮素形态下叶片的Fv/Fm和PIabs均具有不同特点，且随培养时间的变化而改变。

图3 不同氮素形态对2个烤烟品种叶片PSⅡ光化学活性的影响Fig.3 The influence of different nitrogen forms on PSⅡ photochemical activities of leaves of two flue-cured tobacco varieties

处理15d时，Fv/Fm表现为LJ911除T2处理较CK略有降低外，其余施氮处理与CK相比差异均不显著。PIabs表现为LJ911在T1及T3处理中较CK分别增加了87.80%和76.42%，在T2处理中较CK降低了57.67%，差异具有显著性（P＜0.05）。LJ0520施氮处理与CK相比差异均不显著（P＞0.05）。

培养30d时，LJ911在T3处理下的Fv/Fm较CK增加了9.27%，LJ0520不同氮素处理组的Fv/Fm较CK均有增加，且差异显著（P＜0.05）。T1及T3处理使2个烤烟品种的PIabs较CK大幅度提高，差异达到极显著水平（P＜0.01），而T2处理使LJ911的PIabs较CK降低，LJ0520的PIabs较CK升高，差异显著（P＜0.05）。总体来看，T1及T3处理下PIabs的增加幅度表现为LJ911＞LJ0520；T2处理下PIabs的增加幅度表现为LJ0520＞LJ911。

2.2.4 不同氮素形态对烤烟叶片L点和K点相对可变荧光强度的影响 从O-J和O-K的标准化曲线（图4）中可以发现，不同氮素条件对2个品种的VO-J和VO-K均有一定影响。分别将各标准曲线与CK作差得到ΔVO-J和ΔVO-K，进一步明确2个品种在不同处理中表现出的差异，可以发现T2处理下LJ911的VO-J和VO-K显著高于CK，并且处理30d时除T2处理下的LJ911外，2个品种在其他氮素条件下的VO-J和VO-K均低于CK。定量分析中，T2处理下LJ911 2次测定的VL和VK的升高趋势较为明显，而其他处理组的VL和VK均表现为处理15d时与CK无显著性差异，处理30d时显著低于CK（P＜0.05）。对处理30d时进行定量分析，T1处理下LJ911和LJ0520的VL分别较CK降低64.13%和50.92%，T3处理VL分别降低65.90%和81.68%，T1处理VK分别降低64.48%和71.02%，T3处理VK分别降低64.77%和78.34%。

图4 不同氮素形态对2个烤烟品种叶片K点和L点相对可变荧光强度的影响Fig.4 Effects of different nitrogen forms on the relative variable fluorescence intensity at point K and point L of leaves of two flue-cured tobacco

2.3 气体交换参数及叶绿素荧光参数的相关性分析

从表3可以看出，气体交换参数Pn、Gs和Tr之间呈极显著正相关；叶绿素荧光参数Fo和Fm之间呈极显著正相关，PIabs和Fv/Fm之间呈显著正相关。两种参数间，Ci与Fv/Fm之间存在极显著负相关，即Ci越高其相应PSⅡ的Fv/Fm越低；PIabs与Ci和Tr之间存在显著负相关，说明影响光合性能指数的因素较为复杂，需要从多个方面进行分析与考虑。

表3 气体交换参数及叶绿素荧光参数的相关性分析结果Table 3 Correlation analysis result of gas exchange parameters and chlorophyll fluorescence parameters

3 讨论

吴成林等[19]研究发现，白肋烟的烟叶质量与Pn具有一定的相关性，说明烤烟的光合能力与其品质具有紧密的联系。提高烤烟的光合能力，对提高烤烟的品质有着重要的实际意义。

植物的光合作用能力强弱主要从Pn、Tr、Gs和Ci等方面进行综合评价[20]。通常Pn、Tr和Gs三者呈显著正相关，本研究的试验结果支持这一结论。光合作用不仅与自身因素有着密切的联系，同时也受环境因素的影响，如光照、水分和矿质营养等[21]。本试验结果显示，随着培养时间的延长，CK中光合缺氮效应表现得愈发明显，这与王晓琳[22]的研究结果一致，进一步的研究表明氮素形态同样也影响光合作用。对于LJ911烤烟品种而言，首次测定时其在NO3--N处理中光合能力最强，随着培养时间的延长其在NH4+-N和硝铵混合氮处理中的Pn等参数也逐渐增大，这表明一方面氮素对LJ911的光合有促进作用，另一方面其在氮素形态上偏向于对NO3--N的喜好，同时具有较强的适应力。对于LJ0520品种而言，2次测定中均表现为在硝铵混合氮处理的光合能力最强，且随着时间的增加这一优势不断增强，说明在氮素形态上其更偏向于对硝铵混合氮的喜好。

叶绿素荧光参数是反映植物叶片光化学活性的重要指标，可用于具体分析光合机构受外界因素影响的部位，从而更细致地表现植物对光能的吸收、转化、分配与利用等过程[23]。Fm（FP）表示最大荧光强度，在OJIP曲线中与P点相对应，NO3--N及硝铵混合氮处理下LJ911的Fm处于较高水平，而LJ0520的Fm在第2次测定时才表现出在硝铵混合氮处理下较高，这可能与2个烤烟品种对不同氮素形态的响应时间不同有关。比较2次测定结果，第2次测定时FO、FJ、FI和FP低，而光合速率高，两者的变化趋势相反，推测这种现象的出现是由于较强的光合作用中光化学反应消耗了更多的能量，从而使以荧光形式释放出的能量减少造成的[24-25]。

Fv/Fm和PIabs分别为PSⅡ的光化学效率及光合性能指数，它们反映植物受胁迫的情况[26]。不同处理对Fv/Fm的影响在处理15d时并不显著，但在处理30d时表现为NO3--N、硝铵混合氮处理高于CK、NH4+-N处理，说明长时间缺氮影响了烤烟幼苗PSⅡ的光化学效率，而NH4+-N不利于烤烟光化学效率的提高。处理30d时NO3--N和硝铵混合氮处理的PIabs显著高于CK和NH4+-N处理，且LJ0520在硝铵混合氮处理下PIabs为最高，进一步说明LJ0520更偏好于硝铵氮配比为1∶1的氮源条件，此时其光合性能指数更高[27]。综合来看，NO3--N和硝铵混合氮提高烤烟光合性能指数及PSⅡ的光化学效率的作用更加明显，可以使PSⅡ表现出更好的光化学活性。

将OJIP曲线进行O-P标准化，得到2个烤烟品种在各个处理中的VJ和VI，其中VJ代表的意义是J点具有关闭反应中心的数量，也可以用Q-A的积累量来表示。如果在电子传递过程中，去镁叶绿素（Pheo）将电子传递给QA生成QA-后，接下来电子由QA-向QB传递这一过程受到抑制，则表现出VJ增加[28]。从2次测定的结果可以看出，NO3--N和硝铵混合氮使VJ下降，而NH4+-N处理与CK间差异不显著，说明NO3--N和硝铵混合氮可以促进电子从QA-向QB传递的过程，而NH4+-N的作用不明显。

将OJIP曲线进行O-J和O-K标准化，得到2个烤烟品种在各个处理中的VK和VL，它们能够表现植物叶片放氧复合体OEC活性和叶片类囊体膜的解离状态。K点越高说明电子传递从供体侧进入反应中心和离开反应中心到受体侧这一过程越不平衡[29]。处理15d时施氮处理组的VK和VL与CK相比无显著性差异，说明缺氮在短时间内未对放氧复合体OEC和类囊体膜产生显著影响；处理30d时CK组VK和VL显著升高，同时NO3--N和硝铵混合氮VK和VL显著下降，说明随着栽培时间的延长，缺氮使放氧复合体OEC和类囊体膜受到损伤，而NO3--N和硝铵混合氮可以提高OEC的活性和维持类囊体膜的稳定性。相比于上述2种氮素形态，NH4+-N的作用并不明显，对于LJ911有时甚至加剧了OEC和类囊体膜的损伤。

叶片的气体交换参数以及叶绿素荧光参数之间既相互独立又存在一定的关系。相关性分析可以通过函数关系进一步明确二者的关系，可以发现烤烟叶片光化学活性更容易受到Ci的负面影响，即随着Ci的上升，叶片光化学活性可能会随之降低，这不利于叶片对光能的吸收、转化与利用。

4 结论

从光合气体交换参数和叶绿素荧光参数综合来看，氮素的形态对其能够产生一定的影响，进而可以在提高烤烟光合能力方面发挥关键作用。通过对3种氮素条件的对比，发现NO3--N及NO3--N∶NH4+-N=1∶1更有利于烤烟进行高效的光合作用。品种LJ0520更偏爱硝铵氮配比为1∶1的氮素形态；品种LJ911更偏爱硝态氮氮源，同时在其他氮素形态下其光合作用也表现出较强的适应力，但在长期施用铵态氮肥时，可能会降低其叶片放氧复合体的工作效率。据此，根据黑龙江地区特定的气候条件及土壤条件，在LJ911及LJ0520种植过程中应合理施用不同种类的氮肥，尽可能促进其光合性能的提高，提高黑龙江烟区的烤烟产量及品质。