高效液相色谱-串联质谱法测定儿童奶酪中的三聚氰胺*

常晨阳 单 娇 宫小明 潘迎芬

1（聊城海关，山东聊城 252000）

2（黄岛海关，山东青岛 266000）

3（潍坊海关，山东潍坊 261000）

4（东山海关，福建漳州 363401）

三聚氰胺，分子式为C3N6H6，是工业生产中一种重要的氮杂环有机物，在生物体内会水解出三聚氰酸，具有生物毒性，人体长期摄入会造成肾结石等疾病，被严禁用于食品加工生产过程中。但因为其分子含氮量高达66.7%，非法添加到食品中可以虚假提高蛋白质含量，2008 年“三鹿奶粉事件”食品安全事件爆出后，国家对乳制品中三聚氰胺的抽检一直是食品安全监控的重点项目。

近年来，随着乳制品消费升级，零售奶酪市场发展迅速，其中儿童奶酪产品占据了一半以上份额，且呈现不断增长的趋势。儿童奶酪，多属于天然奶酪再加工的产品，呈半固体状，含有较多的蛋白质、脂肪、糖类，基质相对于一般乳液、奶粉更黏稠，提取难度大，比天然奶酪软很多，具有自身独有的特点。

目前已报道的检测三聚氰胺的方法有HPLC法、GC-MS 法、ELISA、毛细管电泳法等，对三聚氰胺的检测研究对象多为乳粉和液态奶，奶酪尤其儿童奶酪兴起较晚，鲜有对其进行检测的技术研究报道。

本文根据儿童奶酪的基质特点，基于QuEChERS 检测原理，结合具有高检测灵敏度的高液相色谱-串联质谱仪，建立了一种可准确测定儿童奶酪中三聚氰胺的快速检测方法，该方法简单，定性、定量准确。相较于国标检测方法GB/T 22388—2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》，无需固相萃取操作和衍生化处理，更为快速、经济，为儿童奶酪制品中有毒有害物质的快速检测提供了参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LCMS-8040 高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪，日本岛津公司；B-400 粉碎均质机，瑞士步琦公司；ME303 电子天平，瑞士梅特公司；L22-500B超声波清洗机，上海皓庄仪器公司；CF16RXⅡ高速离心机，日本日立公司；MS3 Digital 漩涡混合器，德国IKA 公司。

三聚氰胺标准物质，纯度为99.01%，德国Dr.公司；Cleanert C18（size:50 μm，60 A）PestiCarb（200 目～400 目），PSA（40 μm～60 μm），博纳艾杰尔科技公司；中性Al2O3（柱层析用，100 目～200目），天津科密欧公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

取市售儿童奶酪棒产品，粉碎机中打碎，用四分法取100 g 做为分析样品。

称取试样1.0 g（±0.01 g）于50 mL 离心管中，放入陶瓷均质子，加入10 mL2%的三氯乙酸，涡旋混匀2min，超声5min 后，加入3gNaCl固体，25mL乙腈，继续涡旋混匀2 min，10 000 r/min 高速离心5 min，吸取10 mL 上层乙腈层加入0.5 g PSA，0.5 g C18，1.0 g 中性Al2O3，涡旋混匀，10 000 r/min 高速离心5 min 后，过孔径0.2 μm 滤膜后待测。

1.2.2 液相色谱-串联质谱条件

1.2.2.1 液相色谱条件

色谱柱：沃特世Bridge HILIC 柱（3.5 μm×2.1 mm 100 mm）；流动相：溶剂A 为10 mmol/L 醋酸铵，溶剂B 为含10 mmol/L 醋酸铵的乙腈水（V∶V=95∶5）混合溶液；流速:0.4 mL/min；柱温:30 ℃，进样体积:2 μL。

梯度洗脱：0min～1min，0%A，100%B；1min～2.5 min，0%A～20%A，100%B～80%B；2.5 min～3 min，20%A，80%B；3 min～3.1 min，20%A～0%A，80%B～100%B；3.1 min～7 min，0%A，100%B。

1.2.2.2 质谱条件

离子化模式:电喷雾电离ESI（+）；扫描模式：多反应监测MRM模式；碰撞气：Ar；干燥气（N2）流速：10 L/min；雾化器（N2）压力：50 psi；接口温度：350 ℃；DL 温度250 ℃；毛细管电压：3 500 V；加热模块温度：400 ℃。

2.2.3 标准溶液配制

将三聚氰胺标准准物质配制成高浓度标准储备溶液，用50%甲醇水作为配制储备液的溶剂。工作使用液现用现配，使用液相条件的初始流动相进行稀释定容。

2 结果与分析

2.1 提取条件的优化

儿童奶酪多呈凝胶状，蛋白、脂肪含量高，在纯有机溶液乙腈中不溶解，可以将基质在2%三氯乙酸酸性水溶液中预处理，利用陶瓷均质子与超声的协同提取作用，目标物被充分提取后，加入乙腈进行溶剂转换。利用盐包，使乙腈层和水相有效分离，之后用净化包（C18、PSA、中性Al2O3）吸附脂肪、蛋白等杂质进行纯化。

2.2 色谱条件优化

三聚氰胺是强极性物质，在C18色谱柱上不易被保留，利用三聚氰胺的亲水性质，参考FDA 推荐的检测三聚氰胺的方法，选择亲水作用色谱柱（HILIC），可以在高乙腈浓度下被保留，通过提高水相的比例，将三聚氰胺从色谱柱洗脱下来，进入检测器，达到分离检测定性定量目的。本试验中的流动相，选取对比了试验中最常用到的流动性体系：0.1%甲酸水溶液、0.2%甲酸水溶液、10 mol/L醋酸铵、5 mol/L 醋酸铵（含0.1%甲酸水）、甲醇、乙腈体系进行组合试验。发现正离子模式下常用的甲酸水对信号没有明显提高，而10 mol/L 醋酸铵溶液对出峰影响较为显著，乙腈作为流动性有机相优于甲醇，最后维持流动性体系10 mol/L 醋酸铵溶液浓度下，选择乙腈水的流动性配比，确定步骤1.2.2.1 中流动性的比例和及梯度洗脱程序，三聚氰胺在4.1 min 出峰，2 个监控离子对的峰型良好，离子强度高，对应更低的检测限。三聚氰胺标准溶液的离子流色谱图见图1。

图1 三聚氰胺标准溶液的离子流色谱图

2.3 质谱条件优化

使用质量浓度500 μg/mL 的三聚氰胺标准溶液，分别在质谱正负离子模式下对目标物进行全扫描（Scan），结果显示，在正离子模式下的灵敏度高于负离子扫描模式，确定使用ESI 源的正离子模式进行扫描。三聚氰胺分子量为126，扫描到加氢峰质谱信号m/z 127 强信号，为母离子，通过产物离子模式（Product Scan）扫描，找到峰度较强、干扰较小的2 个子离子峰，优化扫描离子和电压，对离子进行微调，得到m/z 84.8 为定量子离子，m/z 67.7作为定性子离子，确定最佳驻留时间、碰撞电压和母子离子电压等质谱参数，确定检测三聚氰胺的MRM条件。三聚氰胺质谱参数见表1。

表1 三聚氰胺质谱参数

2.4 方法的线性范围及定量限

在三聚氰胺质量浓度20 ng/mL～200 ng/mL 范围内，以峰面积Y 为纵坐标，质量浓度X 为横坐标绘制标准工作曲线，得到三聚氰胺的线性方程为Y=174.369X-791，相关系数R2=0.999 1，标准曲线见图2。在空白基质中添加三聚氰胺标准溶液，按信噪比（S/N）大于10 计算，确定本方法的定量限为20 μg/kg，方法灵敏度满足目前国家对奶酪食品中三聚氰胺的限量值为2.5 mg/kg 的监控要求。

图2 三聚氰胺标准工作曲线

2.5 实际样品测定

对市售常见不同品牌儿童奶酪产品（奶酪棒、奶酪杯）应用本方法进行三聚氰胺的检测，未发现阳性样品。对样品进行100 μg/kg 浓度水平加标回收试验，结果见表2。

表2 三聚氰胺加标的回收率和精密度试验结果（n=6）

由表2 可知，加标回收率在80.6%～91.2%，相对标准偏差RSD 均小于10%，满足定性和定量检测要求。

3 结论

儿童奶酪具有不同于其他乳制品的特有基质特点，在前处理中利用QuEChERS 检测原理，对前处理过程进行优化后，经过简单提取净化处理，便可在高效液相色谱-串联三重四极杆质谱联用仪上进行测定。试验结果表明，在20 ng/mL～200 ng/mL 范围内三聚氰胺质量浓度与峰面积有良好的线性关系，相关系数为0.999 1 方法定量限为20 μg/kg，添加水平为100 μg/kg 的加标回收率为80.6%～91.2%测定结果RSD＜10%。该方法操作简单、快速、准确性好、灵敏度高，且无需传统固相萃取操作，节约时间、经济成本，同样适用于大批量样品筛选检测。

我国奶酪市场处于初创时代，尚未为儿童奶酪建立完整的标准制度。随着乳制品的消费升级，奶酪及其制品有着广阔的市场空间，儿童牛乳市场成熟稳定后，下一阶段将走向儿童奶酪的研究。随着监控政策的不断完善，儿童食品行业标准也将会进一步细化，检测标准的制定对研究者提出更多的技术需求，监管检验机构群策群力为中国儿童产品质量安全保驾护航。