低剂量α粒子辐照对斑马鱼胚胎初级造血分子标记物的影响

王慧敏，赵维超,3，胡 南，张燕斌，丁德馨,*

(1.南华大学 铀矿冶生物技术国防重点学科实验室，湖南 衡阳 421001； 2.南华大学 极贫铀资源绿色开发技术湖南省重点实验室，湖南 衡阳 421001； 3.南华大学 公共卫生学院，湖南 衡阳 421001)

铀矿开采及水冶不可避免地会产生废水、废气、废渣，其所释放的氡及其子体产生的放射性污染对环境和人类健康存在潜在威胁，因此相关研究备受关注。氡及其子体衰变产生的α粒子电离能力强、射程短，能与物质产生较强的相互作用。一方面，α粒子能破坏人体的呼吸系统，诱发呼吸道疾病；另一方面，α粒子被吸入体内后，通过血液循环，从胎盘进入胚胎体内，对婴儿造血产生不利影响[1]。目前氡衰变产生的α粒子辐照已成为诱发肺癌的第二大因素；而关于低剂量α粒子辐照对孕期婴儿造血的影响，目前尚未见报道。

斑马鱼的造血过程与哺乳动物相似，包括初级造血和次级造血两个阶段[2]。斑马鱼初级造血发生于10～25 hpf，主要发生在2个区域。其中1个区域位于后部中胚层的中间细胞团(ICM)，是形成红细胞前体细胞的关键位置；另1个区域位于胚胎前部血岛区(RBI)，相当于哺乳动物的卵黄囊，是形成某些髓系细胞前体细胞的关键位置。在初级造血期间参与调控的重要转录因子主要有gata1a、gata2、spi1b、scl、lmo2等[2-3]，其中gata1a为早期红细胞生成的重要转录因子[4]，spi1b为早期髓系细胞生成的重要转录因子[5]，此过程在进化上与人类高度一致[6-9]。已有研究表明，1.4 mGy的α粒子辐照能诱导斑马鱼胚胎产生兴奋效应，表现为24 hpf细胞凋亡的数目明显减少，而当辐照剂量增至2.8、5.6、11.7 mGy时，细胞凋亡数呈线性增加，表明1.4 mGy的α粒子辐照对机体发育具有促进作用[10-11]。

由于脱绒毛膜后的斑马鱼胚胎对外界刺激的敏感度高，且与孕期的婴儿相似，因此本文拟采用241Am作为α粒子辐照源，对其进行低剂量α粒子辐照，以分析其初级造血分子标记物(gata1a和spi1b)的表达水平及初级造血血红蛋白的含量，了解低剂量α粒子辐照对孕期婴儿初级造血系统的影响。

1 材料与方法

1.1 斑马鱼胚胎收集和脱膜处理

野生型AB品系成年斑马鱼，中国科学院水生生物研究所。将斑马鱼雌雄分开并饲养于斑马鱼专用循环系统中，保持恒温(28±1) ℃。严格控制斑马鱼的光周期为14 h光照及10 h黑暗，使其具有稳定的产卵环境。在产卵前一天，选取雌雄比约为1∶2的斑马鱼置于产卵盒中，并用隔板分隔雌雄，产卵盒底部放置带缝隙的挡板，便于收集胚胎。次日清晨8点，移除隔板，并利用光照刺激斑马鱼雌雄交尾，30 min后收集胚胎。收集到的胚胎用E3培养液(含5 mmol/L NaCl、0.33 mmol/L CaCl2、0.33 mmol/L MgSO4·7H2O和0.085 mmol/L KCl)清洗数次，将鱼鳞、粪便、丰年虾壳及其他杂物完全洗净，用于后续实验。

由于斑马鱼胚胎的绒毛膜能吸收大部分α粒子辐照，因此需在辐照实验开始前脱除斑马鱼绒毛膜。取150枚左右胚胎置于培养皿中，将水吸净，加入浓度为0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化液使其没过胚胎，静置消化10 min左右，在光学显微镜下观察到小部分胚胎的绒毛膜脱落时停止消化，用E3培养液清洗5次以上后置于恒温培养箱中培养。

1.2 胚胎的α粒子辐照

将5 hpf脱绒毛膜后的胚胎放入底部带有2 mm孔的培养皿中，使用快固胶将1张12 μm厚的聚酯迈拉膜固定在培养皿底部。移动胚胎，使胚胎的细胞朝向孔。使用241Am(天津市博安科工贸有限公司)进行辐照，根据文献[12]的方法，使用辐照5 min后的最大辐照剂量，计算得辐照剂量率约为1.7 mGy/min。控制辐照时间分别为15、30、60 s，斑马鱼胚胎接受的辐照剂量分别为0.425、0.85、1.7 mGy，α粒子的辐射权重因子为20，因此脱绒毛膜后的斑马鱼胚胎受到的有效剂量应为当量剂量与辐射权重因子的乘积，具体参数列于表1。受辐照条件限制，一次辐照2枚胚胎，所有剂量组胚胎在1.5 h内辐照完毕。辐照后置于恒温培养箱中，期间每隔6 h更换E3培养液，继续孵化至14 hpf和22 hpf，待后续处理。

表1 辐照参数Table 1 Irradiation parameter

1.3 斑马鱼胚胎初级造血分子标记物gata1a和spi1b表达的检测

采用整体原位杂交技术检测斑马鱼胚胎初级造血前期分子标记物gata1a和spi1b的表达。斑马鱼的初级造血发生在10～25 hpf，实验选择发育至约14 hpf的胚胎进行检测。采用整体原位杂交技术，可直观地看到斑马鱼胚胎初级造血前期分子标记物gata1a和spi1b在斑马鱼胚胎上表达的具体位置和大致含量。使用4%多聚甲醛固定胚胎不超过2 h，随后用无水乙醇进行梯度脱水，于-4 ℃下冷藏过夜，并保存于-20 ℃。标记物gata1a和spi1b的表达采用文献[13]方法进行检测。

斑马鱼胚胎初级造血发生在10～25 hpf，发育至22 hpf时，初级造血已基本完成，采用实时荧光定量聚合酶链式反应技术可定量检测斑马鱼胚胎初级造血后期分子标记物gata1a和spi1b的相对表达，验证前期整体原位杂交技术检测的结果。22 hpf时，各剂量组选取约50枚脱绒毛膜后的胚胎，采用 trizol 法提取各剂量组的总RNA，超微量核酸蛋白测定仪(scandrop100)检测RNA在260 nm和280 nm处的吸光度，由此确定RNA溶液的浓度。采用Aidlab公司反转录试剂盒(TUREscript 1st Stand cDNA Synthesis Kit)进行反转录操作，采用20 μL反应体系(总RNA 500 ng，5×RT Reaction Mix 4 μL，Rondam primer/oligodT 1 μL，TUREscript H-RTase/RI Mix 1 μL，RNase Free dH2O 至 20 μL)合成cDNA第一链，于-80 ℃保存。qRT-PCR程序反应结束后分析荧光度变化曲线和溶解曲线以确定扩增目的基因片段的特异性。以GAPDH 基因作为内参，采用2-ΔΔCt(Ct为每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数)法计算各基因相对表达量，相关基因引物序列列于表2。

表2 相关基因引物序列Table 2 Sequences of primers of related genes

采用联大茴香胺染色法检验初级造血阶段红细胞中血红蛋白的表达情况，以进一步确定α粒子辐照对初级造血中原始红细胞发育的影响，具体方法如下：各剂量组选取约10枚脱绒毛膜后的胚胎，正常培养至48 h，分别加入联大茴香胺混合染色液(含0.7 mg/mL联大茴香胺溶液、0.5 mL 0.01 mol/L醋酸钠溶液、0.1 mL 30%过氧化氢、0.2 mL去离子水)，常温下避光显色15 min。清洗3～5次后，置于显微镜下观察并拍照。

1.4 数据分析

使用Graphpad Prism 8进行数据分析。用单因素方差分析法分析组间差异，p>0.05时无统计学意义；p<0.05时差异有统计学意义；p<0.01时差异显著；p<0.001时差异极显著。

2 结果与讨论

2.1 α粒子辐照对斑马鱼初级造血分子标记物表达的影响

1)gata1a和spi1b的相对表达

qRT-PCR检测的各组gata1a和spi1b基因的相对表达示于图1。由图1可见，与对照组相比，22 hpf时0.425 mGy剂量组胚胎中gata1a表达量无显著性差异(p>0.05)，0.85 mGy剂量组gata1a表达量明显降低(p<0.01)，而1.7 mGy剂量组gata1a表达量明显升高(p<0.001)。0.425 mGy剂量组spi1b表达量降低(p<0.05)，0.85 mGy剂量组表达量显著降低(p<0.01)，而1.7 mGy剂量组spi1b表达量极显著升高(p<0.001)。

2)gata1a和spi1b在斑马鱼胚胎上的表达位置

从图1可知，剂量为0.425 mGy和0.85 mGy的α粒子辐照能抑制胚胎的初级造血，且具有剂量依赖性，而1.7 mGy能促进胚胎初级造血。为进一步明确α粒子辐照对胚胎初级造血系统的影响，了解分子标记基因的表达范围，采用整体原位杂交技术检测了胚胎发育至约14 hpf时α粒子辐照对其造血分子标记物gata1a和spi1b表达的影响，结果示于图2，所有胚胎均为侧面观，头部向左尾部向右。由于每个剂量组非同一批取样，因此同一基因各剂量组表达模式略有不同。由图2可见，对照组胚胎gata1a与1.7 mGy剂量组胚胎的表达模式类似，主要在后部侧板中胚层(ICM区)表达(图2a、d)，0.425 mGy和0.85 mGy剂量组表达模式类似，目标基因出现了非特异性的异位表达，其表达范围异位扩展至前部侧板中胚层(图2b、c)。与对照组相比，0.425 mGy和0.85 mGy剂量组紫色杂交信号减弱，表明胚胎gata1a表达明显降低，而1.7 mGy剂量组紫色杂交信号增强，表明gata1a表达显著升高。对照组胚胎的spi1b表达与1.7 mGy剂量组模式最为接近，在整个胚胎部分均有表达(图2e、h)，0.425 mGy和0.85 mGy剂量组表达模式类似，主要在胚胎的前部侧板中胚层头端表达(图2f、g)。0.425 mGy剂量组胚胎spi1b表达无明显变化，0.85 mGy剂量组表达明显降低，同样值得注意的是，1.7 mGy剂量组紫色杂交信号增强，spi1b的表达显著升高(图2h)。

*——p<0.05；**——p<0.01；***——p<0.001图1 22 hpf斑马鱼胚胎接受α粒子辐照后gata1a和spi1b的相对表达量Fig.1 Expression levels of gata1a and spi1b of zebrafish embryo at 22 hpf after α particle irradiation

图2 约14 hpf斑马鱼胚胎α粒子辐照后的gata1a(a、b、c、d)和spi1b(e、f、g、h)表达Fig.2 Expression of gata1a (a, b, c, d) and spi1b (e, f, g, h) in about 14 hpf zebrafish embryos after α particle irradiation

3) 血红蛋白的变化

α粒子辐照后48 hpf斑马鱼胚胎中血红蛋白的含量示于图3，红色箭头所指为血红蛋白，颜色越深，红色范围越大说明血红蛋白含量越多。与对照组相比，0.425 mGy剂量组血红蛋白含量并无显著性差异，0.85 mGy剂量组血红蛋白含量减少，而1.7 mGy剂量组血红蛋白含量高于对照组。同时，与对照组相比，根据统计染色的胚胎数量和染色信号的增强或减弱，得到量化血红蛋白含量的差异百分比柱状图(图4)。胚胎发育至48 hpf时，0.425、0.85和1.7 mGy剂量组染色信号减弱的百分比分别约为29%、84%和15%；其染色信号增强百分比约为16%、5%和70%。

图3 α粒子辐照后胚胎的血红蛋白含量变化Fig.3 Hemoglobin content of each group after α particle irradiation

图4 血红蛋白染色信号百分比Fig.4 Hemoglobin staining signal percentage

2.2 讨论

本实验中，在低于0.85 mGy的剂量下，随着辐照剂量的增加gata1a和spi1b的相对表达量逐渐降低；在高于0.85 mGy的剂量下，随着辐照剂量的增加gata1a和spi1b的相对表达量增加。这种在一定的低剂量范围内，随着辐照剂量的增加α粒子辐照抑制造血的现象被称作低剂量辐射超敏感性(HRS)，超出一定的剂量后，α粒子辐照促进造血的现象被称为诱导辐射抗性(IRR)，在HRS/IRR现象中发挥重要作用的是DNA损伤修复机制。辐照能致使胚胎发生直接或间接的DNA损伤，当DNA损伤积累到一定程度时，即可激活细胞增殖周期内的G2期检查点，抑制G2期受损细胞进入M期，使得受损细胞在此得到修复并出现周期性停滞，产生明显的抗辐射能力[14-17]。马季等[18]研究了X射线(0～1.2 Gy)分别对DNA-PKcs野生型M059K和突变型M059J两株基因的影响，检测了X射线辐照后60 min内G2期检查点相关蛋白的变化情况，结果发现，1 Gy照射后野生型M059K产生了HRS，并发现0.2 Gy的X射线辐照后，20～50 min内野生型M059K的G2期检查点相关蛋白pChk1和pChk2活化增强，pChk1/Chk1和pChk2/Chk2的比值显著高于突变型，表明G2期检查点在诱导HRS现象中具有重要作用。Wu等[19]研究了0.05～2 Gy的X射线辐照对A549细胞的HRS相关作用机制，发现当辐照剂量小于0.3 mGy以及大于0.5 Gy时，A549细胞存活率明显降低；而当辐照剂量为0.3～0.5 mGy时，A549细胞存活率明显升高。此外，照射后1 h，Chk2激酶开始被激活，照射后2 h，M期细胞比例显著下降，说明此时G2期检查点被激活且Chk2激酶在G2期检查点激活过程中起关键作用。在本实验中，当辐照剂量小于0.85 mGy时，可能G2期检查点未被激活，导致DNA受损的细胞无法得到修复，胚胎细胞对α粒子辐照敏感性增强，从而抑制斑马鱼造血，表现为随着辐照剂量的增加，gata1a和spi1b的相对表达量逐渐降低；而当辐照剂量达到1.7 mGy时，可能G2期检查点被激活，DNA受损的细胞得到修复，细胞存活率增加，诱导了低剂量兴奋效应，促进斑马鱼造血[20]，表现为随着辐照剂量的增加，gata1a和spi1b的相对表达量增加。

HRS/IRR现象在很多研究中得到了验证。当α粒子辐照剂量低于2.8 mGy时，24 hpf的胚胎细胞凋亡信号显著减少，而辐照剂量大于5.6 mGy时，24 hpf的胚胎细胞凋亡信号显著增加[21-22]。贾晓娟等[23]发现单次辐照剂量为1、2、4 Gy时，能促进外周血淋巴细胞的生长，具体表现为染色体形成率和培养形成的大核数明显高于空白对照组；而当辐照剂量大于4 Gy时，染色体形成率和大核数明显减少，对外周血淋巴细胞的生长具有抑制作用。Marques等[24]发现低剂量电离辐射上调了斑马鱼幼虫的内皮细胞中几种促血管生成分子的基因表达，如flt1、kdr、angpt2a、tgfb2、fgf2和cyr61，同时促进了胚后发育。这些研究与本文研究的结果相似，小于0.85 mGy的低剂量α粒子辐照对脱绒毛膜后的斑马鱼胚胎初级造血产生了抑制作用，而1.7 mGy的低剂量α粒子辐照诱导了脱绒毛膜后的斑马鱼胚胎初级造血兴奋效应。

3 结论

小于0.85 mGy的低剂量α粒子辐照对脱绒毛膜后的斑马鱼胚胎初级造血产生了抑制作用(对应于人体8.5 mGy辐照剂量)，而1.7 mGy的低剂量α粒子辐照诱导了脱绒毛膜后的斑马鱼胚胎初级造血兴奋效应(对应于人体17 mGy辐照剂量)，因此，1.7 mGy的低剂量α粒子辐照对脱绒毛膜后的斑马鱼胚胎初级造血具有促进作用。

这一结论表明，孕期的婴儿在接受低剂量α粒子辐照后，其初级造血产生了低剂量兴奋效应，但1.7 mGy的α粒子辐照剂量可能尚未达到诱导低剂量辐照兴奋效应的最大值。因此，在后续研究中，还需进一步确定低剂量α粒子辐照兴奋效应的阈值。