甘肃省兴隆山区域丛枝菌根真菌多样性初探

董万清，闫智臣，邓 杰，李应德，丁婷婷，段廷玉

（兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室 / 兰州大学农业农村部草牧业创新重点实验室 /兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020）

菌根是植物根系在漫长进化过程中与土壤真菌构建的互惠共生体，作为生态保护和农牧业发展的重要参与者，其在经济、社会和生态方面均发挥着不可替代的作用[1]。菌根真菌作为菌根共生体的关键性要素，受到学者的广泛关注，尤其是丛枝菌根(arbuscular mycorrhizal, AM)真菌，可与80%的陆地植物构建共生关系[2]，且对生存环境要求较低，在森林、草原、沙漠、农田、河漫滩、盐碱地、工业污染区等各种环境条件下均能存活[3-9]，不仅能促进植物生长[10-11]、优化根系养分吸收[12-13]、改善土壤结构[14]、增强植物抗逆性(抗病性、抗旱性、耐盐性、耐金属性等)[15-18]，还可参与调控所处生态系统的稳定性和生产力[19-20]，在生态系统中承担着极其重要的角色。因此，AM 真菌资源调查日益受到国际社会的重视[21]。

我国是世界上物种多样性最高的国家之一，截止2018 年，国内已发现AM 真菌虚拟种145 个，涵盖8 科12 属，约占全球已知AM 真菌的42%，这表明我国贮藏着丰富的AM 真菌资源，具有巨大的开发潜力和应用价值[22]。近年来，诸多学者在全国范围内展开AM 真菌资源分布、物种多样性、群落特征、发生规律等相关调查研究[6,9]，以便全面了解和掌握各地区AM 真菌资源现状。然而，我国国土面积辽阔，气候类型复杂，植被多样性高，极易受小气候影响而形成特殊生态系统，所以尚有诸多地区未进行AM 真菌资源调查，且AM 真菌多样性在不同气候、生境下的分布差异较大，因此，要全面掌握我国AM 真菌多样性的整体情况，仍需要进行大量的调查研究[22]。

甘肃省兴隆山国家级自然保护区地处东亚内陆，因其地理位置的独特性，被称为隔离的“林岛”[23]。作为森林生态系统，保护区内植物资源丰富，现存高等植物1 022 种，常形成乔灌草混合林带，被称为甘肃境内植物资源“基因库”[23]。而植物多样性往往与AM 真菌多样性密切相关，两者间存在着积极的作用[2,24]。因此，保护区内可能蕴藏着丰富的AM 真菌资源，且其在维持和保护当地生态系统的稳定和发展方面可能发挥着重要作用，但目前尚缺乏该方面的基础资料，所以有必要开展相关AM 真菌多样性调查工作。

基于此，本研究以兴隆山自然保护区为研究地，在不同海拔高度开展AM 真菌资源分布及多样性调查工作，以期为兴隆山AM 真菌资源应用提供数据资料，并丰富已知AM 真菌种质资源库，为后续研究工作的开展奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样地概况

甘肃省兴隆山国家级自然保护区是兰州市榆中县(103°50′ − 104°10′ E, 35°38′ − 35°58′ N)重要的生态屏障，受地形和海拔的影响，保护区内气候差异较大，年平均气温3～7 ℃，年均降水量为340～520 mm[25-26]。植被种类丰富，主要有青杄(Picea wilsonii)、小檗(Berberis thunbergii)、珍珠梅(Sorbaria sorbifolia)、白莲蒿(Artemisia sacrorum)等。兴隆山是保护区内三大山脉(兴隆山、马衔山和栖云山)之一，分为东、西两峰，海拔约2 500 m。

1.2 样品采集

本研究以植被丰富的兴隆山东山(乔灌草混合林带)为研究样地，选取2 000～2 600 m 海拔区域，于2019 年8 月按纵轴方向自下而上采集土壤样品共计40 份。样地以海拔高度为基准，选取了8 个海拔梯度，各海拔间间隔约50 m，从低到高依次为2 168、2 209、2 261、2 313、2 361、2 408、2 466 和2 601 m。不同海拔梯度内设置5 个样点，各样点按等边三角形三点取样，采集0 - 10 cm 表层土壤，过2 mm 土壤筛后，将3 个分样品混合均匀，取一定量土壤于2 mm 离心管内，准确编号后带回实验室，置于−80 ℃冰箱保存，后送至北京百迈客生物科技有限公司测序。

1.3 AM 真菌多样性测序

1.3.1 土壤DNA 提取及PCR 扩增

采用MN NucleoSpin 96 Soi 试剂盒法提取土壤样品基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检测DNA 提取效果，并进行PCR 扩增。第一次PCR：取适量DNA 样品，用无菌水稀释至1 ng·μL−1，以其为DNA模板，根据选定的测序区域，使用特异性引物AMV4.5NF-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG、AMDGRCCCAACTATCCCTATTAATCAT 进行扩增，反应条件为95 ℃预热5 min；25 个循环：95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s；72 ℃延伸10 min。

第二次PCR：对上述目标区域PCR 纯化产物进行稀释，并以其为模板进行PCR，98 ℃预热30 s；10个循环：98 ℃变性10 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；72 ℃延伸5 min。扩增完成后，对其产物进行1.8%琼脂糖凝胶电泳检测。根据PCR 产物浓度进行1 : 1 等量混样，并利用OMEGA DNA 纯化柱纯化，于1.8%琼脂糖凝胶电泳检测，后进行切胶回收。

1.3.2 上机测序及数据处理

AM 真 菌 多 样 性 检 测 选 择 Illumina HiSeq 测 序平台，测序结束后选用FLASH[27](version 1.2.11)和Trimmomatic[28](version 0.33)软件对原始数据进行双端拼接及质量过滤，获得高质量Tags 序列，之后通过UCHIME[29](version 8.1)软件完成嵌合体清除过程，获得有效数据。

1.3.3 物种注释和分类学分析

采用Usearch 软件[30]在97%的相似度水平下对优化序列进行聚类，以测序所有序列数的0.005%为阈值过滤OTU，并结合NCBI 和MaarjAM 数据库信息，对其代表序列进行物种注释，以确定不同分类水平下(门Phylum, 纲Class, 目Order, 科Family, 属Genus,种Species)各样品中AM 真菌的群落构成及其系统发育关系。

1.4 统计分析

使用R 3.6.1 软件[31]计算样品物种水平Alpha 多样性指数；利用Excel[32]柱状堆积图和饼状图分别表示AM 真菌相对丰度和物种组成；采用SPSS 22.0[33]单因素方差分析和多重比较的检验方法比较不同海拔间AM 真菌多样性指数的差异，Spearman 相关性分析描述AM 真菌多样性指数与海拔因子的相关性；运用MEGA 7[31]绘制不同AM 真菌系统进化树。

2 结果与分析

2.1 AM 真菌种属分类

在一定范围内，随着测序条数的加大，稀释曲线总体上趋于平缓(图1)，说明本研究测序数据量足以反映当地土壤中AM 真菌的基本情况，可以进行后续数据分析。

图1 样品稀释曲线Figure 1 Sample rarefaction curves

本研究分离获得AM 真菌共52 种，隶属于4 目8 科13 属(表1)，具体为原囊霉目(Archaeosporales)2 科2 属，多样孢囊霉目(Diversisporales) 3 科4 属，球 囊 霉 目(Glomerales) 2 科6 属， 类 球 囊 霉 目(Paraglomerales) 1 科1 属。通过对测序OTU 代表序列进行数据库比对，采用邻接法(Neighbor-joining)进行系统进化分析(图2、图3)，鉴定为球囊霉属(Glomus) 20 种，原 囊 霉 属 (Archaeospora) 9 种，类球 囊 霉 属 (Paraglomus) 6 种， 近 明 球 囊 霉 属(Claroideoglomus) 5 种，多样孢囊霉属 (Diversispora)3 种，硬 囊 霉 属 (Sclerocystis) 2 种，双 型 囊 霉 属(Ambispora)、无梗囊霉属 (Acaulospora)、盾巨孢囊霉属 (Scutellospora)、巨孢囊霉属 (Gigaspora)、多氏囊霉属 (Dominikia)、根孢囊霉属 (Rhizophagus)和斗管囊霉属 (Funneliformis)各1 种。但部分菌种系统进化发育并不完全符合规律，如球囊霉属的Glomus sp.2、Glomus sp.6、Glomus sp.8、Glomus sp.10、Glomus sp.11 和Glomus sp.12，其在进化树中与其他同属菌种并未聚在同一分支(图3)。

表1 Arbuscular mycorrhizal (AM)真菌种属分类Table 1 Classification of arbuscular mycorrhizal fungal species

续表1Table 1 (Continued)

图2 属水平上arbuscular mycorrhizal 真菌的物种数目Figure 2 The number of arbuscular mycorrhizal fungal species at the genus level

2.2 AM 真菌丰度及海拔分布特征

2.2.1 不同海拔梯度AM 真菌资源分布

兴隆山东山地区AM 真菌资源分布总体上表现为：优势种属和特有种属随海拔变化呈现规律性分布，其余各属种则均匀分布于不同海拔梯度。属水平上，从低海拔到高海拔，AM 真菌优势属由球囊霉属逐渐转变为类球囊霉属(除2 168 m 海拔梯度)，其中球囊霉属在2 209～2 313 m海拔范围内为优势属，分别占各海拔的73.87%、81.23%和47.10%，类球囊霉属为2 361～2 601 m 海拔优势属，占各海拔的72.50%～89.41%；无梗囊霉属和巨孢囊霉属为部分海拔特有属(图4)。

不同海拔梯度AM 真菌种水平上组成存在差异(表2)。类球囊霉属sp.2、球囊霉属sp.8 和近明球囊霉属sp.1 为该地区不同海拔优势种，其类球囊霉属sp.2 为各海拔共有优势种(除2 261 m 海拔外)，球囊霉属sp.8 在2 209～2 313 m 和2 466 m 海拔内为优势种，近明球囊霉属sp.1 为2 313 m 海拔优势种。蜜色无梗囊霉、球状巨孢囊霉、白色球囊霉、球囊霉属sp.1、球囊霉属sp.4 和弯丝硬囊霉仅在部分海拔梯度出现，分别为不同海拔特有种。

2.2.2 不同海拔AM 真菌多样性

不同海拔AM 真菌多样性指数(表3)显示，测序文库覆盖度均在0.999 9 以上，测序结果准确可靠。在97%相似性水平下，沿低海拔至高海拔梯度，Chao1 和ACE 指数总体上呈现出先增后减的变化趋势(除2 168 m 海拔外)，且在2 361 m 海拔梯度达到峰值。其中，在2 361 m 时，Chao1 指数极显著高于2 209、2 408 和2 466 m (P ＜ 0.01)，ACE 指数显著高于2 408 m (P ＜ 0.05)。Simpson 指数和Shannon指数在不同海拔间差异均不显著，表明各海拔梯度物种多样性组成相似。

2.3 AM 真菌分布与海拔高度相关性

图3 Arbuscular mycorrhizal 真菌系统进化树Figure 3 A phylogenetic tree of arbuscular mycorrhizal fungi

图4 Arbuscular mycorrhizal 真菌属水平相对丰度Figure 4 The relative abundance of arbuscular mycorrhizal fungi at the genus level

利用AM 真菌丰富度和多样性指数(Chao1、ACE、Shannon 和Simpson 指数)与海拔高度进行Spearman相关性分析，结果表明各指数与海拔间相关系数依次为−0.291, −0.277, 0.026 和−0.041，均未达到显著水平(P ＞ 0.05)，说明该地区AM 真菌资源分布受海拔因子的影响较小，两者间不具有直接的相关性。

3 讨论

兴隆山自然保护区作为甘肃兰州榆中县的“绿色岩岛”，因其独特的地理位置，对当地生态稳定、物质循环、能量流动等方面具有重要意义，保护区基于气候、海拔、土壤等多种环境因子综合调控，孕育了丰富的生物资源[34-35]。本研究首次对兴隆山东山AM 真菌资源多样性进行调查研究，并分析了海拔高度对其种属分布的影响，研究结果是对我国AM 真菌资源分布情况的有益补充。

利用AM 真菌最新分类系统对高通量测序结果进行种属鉴定，发现研究区内AM 真菌可分为4 目8 科13 属52 种，约占我国已知AM 真菌总数的三分之一，说明兴隆山东山AM 真菌资源较丰富。因此，后续工作应扩大调查范围，对兴隆山自然保护区其余地区深入开展资源调查工作，以全面了解和掌握该地区的AM 真菌资源状况，丰富我国已知AM 真菌种质资源数据库。

不同AM 真菌对环境因子的适应性不同，常因环境条件的差异而呈现不均衡分布[36]。本研究表明，兴隆山东山不同海拔梯度下AM 真菌优势种属随海拔变化呈现规律性变化，其中球囊霉属在2 209～2 313 m 海拔为优势属。尚昆等[37]对梵净山不同海拔AM 真菌多样性的研究表明，球囊霉属在梵净山地区主要分布于1 800 m 海拔以下地区，在2 100～2 200 m 海拔范围内未见其分布，而蔡晓布和彭岳林[38]研究发现，球囊霉属可在西藏高原2 200～5 300 m 海拔地区广泛分布，说明AM 真菌在水平和垂直方向的种属分布可能受海拔及由此引致的温度等因素的调控，且球囊霉属具有较为广泛的生态适应性，可分别在低、中、高海拔地区生存。

诸多研究表明，同一研究区内，不同海拔梯度下AM 真菌丰富度及物种多样性存在显著差异[38-39]。本研究中AM 真菌丰富度指数在部分海拔间存在显著差异，且随海拔变化呈现出“单峰”分布，但物种多样性指数在不同海拔梯度间差异较小，未表现出显著差异。Gai 等[40]对西藏高原地区AM 真菌多样性研究发现，随海拔高度的增加，AM 真菌物种多样性指数无明显变化，这与本研究结果保持一致，但尚昆等[37]和Wu 等[41]对梵净山和富士山AM 真菌群落相关研究中发现，AM 真菌多样性随海拔的增加分别呈现出增加和减少的趋势。由此可见，不同地区AM 真菌多样性分布随海拔变化的分布状况不尽一致。与此类似，研究区不同，海拔高度对AM 真菌丰富度指数的影响也不同。李晓亮[42]对藏东南地区海拔对AM 真菌多样性及群落结构影响的研究发现，海拔可直接影响AM 真菌OTU 丰富度，而李龙等[43]在高黎贡山的研究中表示，随海拔的升高，AM 真菌丰富度指数逐渐降低，但其原因主要是不同海拔间植物丰富度和土壤理化性质不同而引起的变化，即海拔间接影响该地区AM 真菌物种丰富度。

表2 不同海拔arbuscular mycorrhizal 真菌物种组成Table 2 The composition of arbuscular mycorrhizal fungal species at different altitudes

续表2Table 2 (Continued)

根据不同海拔间AM 真菌多样性分布结果分析可知，AM 真菌物种丰富度及多样性受海拔因子的调控。本研究中，研究区内AM 真菌资源分布特征在一定程度上受海拔变化的影响，但相关性不显著。经分析，原因可能有以下两个方面：一是研究区内海拔跨度较小，不同海拔间环境条件基本一致，不足以引起AM 真菌群落的显著性差异。蔡晓布和彭岳林[35]对西藏高原AM 真菌群落相似度分析结果表明，同一海拔区内，不同海拔梯度间差异越小，其AM 真菌群落特征相似性越高；Pérez 和Frangi[44]也发现，在草原生态系统中，绝对海拔低且海拔间跨度较小时，海拔对AM 真菌群落无影响。二是影响AM 真菌种属组成及多样性分布的环境因素较多，如植物种类、土壤有机质、pH、温度、降水量等，推测海拔高度可能不是直接影响兴隆山东山AM 真菌资源分布的主导因子，但具体情况有待进一步研究。

表3 不同海拔arbuscular mycorrhizal 真菌多样性指数Table 3 Diversity indices for arbuscular mycorrhizal fungi at different altitudes

此外，本研究中AM 真菌资源在2 168 m 海拔梯度的分布状况并不遵循其他海拔的变化规律，分析原因可能是该海拔位于东山旅游区入口附近，受人类活动干扰较大，致使其AM 真菌群落随海拔等环境因子的规律性分布遭到了破坏，应加以保护。

4 结论

甘肃省兴隆山东山AM 真菌资源丰富，约52 种，隶属于4 目8 科13 属，其中Glomus 和Paraglomus 为优势属，Glomus albidum、Acaulospora mellea、Gigaspora margarita、 Glomus sp.1、 Glomus sp.4、 Sclerocystis sinuosa 为部分海拔特有种，上述优势物种及特有物种分布表现出了一定的海拔特异性。