舒芬太尼联合酮咯酸氨丁三醇对大鼠创面愈合及瘢痕的影响

管钊铭 ，吴晓炀 ，刘俊江 ，刘岩 ，于淼 ，徐松龄

1.牡丹江医学院第一临床医学院，黑龙江牡丹江 157011；2.牡丹江医学院附属红旗医院麻醉科，黑龙江牡丹江 157011

目前，随着镇痛药物和镇痛技术的不断更新，术后镇痛已被广泛应用[1]。有效的术后镇痛不但可以减轻患者痛苦，还有利于创面愈合，而创面愈合必然伴随着瘢痕组织的形成。在创面愈合的过程中，一旦胶原纤维生成异常，就会形成病理性瘢痕，可能会对患者机体功能方面带来影响。作为目前临床上常用的镇痛药物，舒芬太尼和酮咯酸氨丁三醇可用于术后镇痛，并且舒芬太尼联合酮咯酸氨丁三醇有利于创面愈合[2]。该课题在 2019 年 10 月—2020 年 1 月期间选取64 只SPF 级雄性SD 大鼠研究舒芬太尼和酮咯酸氨丁三醇对SD 大鼠血液中白介素 (Interleukin,IL)IL-1和IL-10，创面周围组织粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的表达以及对创面愈合情况和瘢痕组织的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF 级雄性 SD 大鼠 64 只，体重(380±20)g。大鼠IL-1、IL-10、GM-CSF ELISA 检测试剂盒和 BCA 蛋白定量试剂盒。枸橼酸舒芬太尼注射液 (国药准字H20054171)、 酮咯酸氨丁三醇注射液 (国药准字H20193142)。

1.2 方法

1.2.1 分组 SD 大鼠随机分为4 组，分别为：酮咯酸氨丁三醇组(T 组)、舒芬太尼组(S 组)、酮咯酸氨丁三醇+舒芬太尼组(T+S 组)、空白对照组(C 组)。

1.2.2 模型制备 用 0.6%戊巴比妥钠 (国药准字H31021725)以0.1 mL/10 g 进行腹腔麻醉，麻醉后剪去其颈背部体毛，以脊柱为中线做一约1 cm×1 cm 大小的皮肤全层缺损。

1.2.3 给药方法 T 组大鼠注射酮咯酸氨丁三醇(国药准字 H20193142)3.5 mg/（kg·12 h），S 组大鼠注射舒芬太尼 (国药准字 H20054171)1.5 μg/（kg·12 h），T+S组大鼠注射酮咯酸氨丁三醇 (国药准字H20193142)3.5 mg/（kg·12 h）和舒芬太尼(国药准字 H20054171)1.5 μg/（kg·12 h），C 组大鼠注射 0.9%氯化钠注射液，各组差量用生理盐水补齐。从大鼠鼠尾静脉进行给药，每12 小时给药1 次，每日定时给药，直至创面愈合。

1.2.4 标本处理 在第 3、7、10 天，每组随机取 4 只大鼠抽取外周静脉血，离心取血清液，用ELISA 检测大鼠血清中IL-1 和IL-10 的含量。剪取创缘5 mm×5 mm皮肤组织，分成2 份，一份用 ELISA 法测定GM-CSF的表达；另一份用于制作苏木精-伊红染色(HE 染色)病理切片。每组最终剩余大鼠用来观察创面愈合时间和瘢痕面积。

1.3 观察指标

1.3.1 IL-1、IL-10 和 GM-CSF 的表达 在第 3、7、10 天，检测血清中IL-1、IL-10 的浓度和组织中GMCSF 的浓度。为了避免取材误差，使用BCA 蛋白法检测各组织的蛋白浓度，应用GM-CSF 的浓度/蛋白浓度的比值来观察GM-CSF 的表达[3]。

1.3.2 创面愈合时间和愈合后瘢痕面积 记录各组大鼠创面愈合时间和愈合后瘢痕组织的面积。

1.3.3 HE 染色 各组大鼠皮肤放置在4%的甲醛溶液固定48 h，取出后进行脱水，石蜡包埋，切片，进行HE 染色。

1.4 统计方法

采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析，计量资料的表达方式为（±s），两组间比较采用 t 检验,多组间比较采用F 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠血清中IL-1 的表达

在第 3、7、10 天，T+S 组的 IL-1 的浓度低于 C 组和 S 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 4 组大鼠血清 IL-1 含量比较[（±s），pg/mL]

表1 4 组大鼠血清 IL-1 含量比较[（±s），pg/mL]

注：与 C 组比较，aP＜0.05；与 T 组比较，bP＜0.05；与 S 组比较，cP＜0.05

组别 第3 天 第7 天 第10 天C 组(n=4)T 组(n=4)S 组(n=4)T+S 组(n=4)F 值P 值132.67±9.56 132.81±13.45 140.43±11.65（104.56±16.63）abc 5.831 0.011 150.51±9.11（130.10±10.24）a 137.91±13.78（114.15±8.70）ac 8.162 0.003 156.75±4.71（128.91±9.11）a（145.56±14.28）b 114.90±6.07）ac 15.656<0.001

2.2 大鼠血清中IL-10 的表达

在第 7、10 天，T+S 组的 IL-10 的浓度高于 C 组和 T 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 4 组大鼠血清中 IL-10 含量比较[（±s），pg/mL]

表2 4 组大鼠血清中 IL-10 含量比较[（±s），pg/mL]

注：与 C 组比较，aP＜0.05；与 T 组比较，bP＜0.05；与 S 组比较，cP＜0.05

组别 第3 天 第7 天 第10 天C 组(n=4)T 组(n=4)S 组(n=4)T+S 组(n=4)F 值P 值151.73±10.05 154.23±16.57 160.50±9.73 167.11±12.56 1.208 0.349 112.07±10.15 114.27±10.25 112.55±7.40（142.35±10.94）abc 9.063 0.002 154.90±5.39（126.73±13.79）a（162.71±10.25）b（176.70±7.08）ab 18.938<0.001

2.3 大鼠组织中GM-CSF 的表达

在第 3 天，C 组的 GM-CSF/BCA 的比值低于其他组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 4 组大鼠组织中 GM-CSF/BCA 比值比较（±s）

表3 4 组大鼠组织中 GM-CSF/BCA 比值比较（±s）

注：与 C 组比较，aP＜0.05；与 T 组比较，bP＜0.05；与 S 组比较，cP＜0.05

组别 第3 天 第7 天 第10 天C 组(n=4)T 组(n=4)S 组(n=4)T+S 组(n=4)F 值P 值16.98±0.56（19.09±0.50）a（18.79±0.49）a（18.19±0.61）ab 11.098 0.001 14.73±0.86（16.30±0.93）a（10.92±0.55）ab（13.40±0.75）abc 33.658<0.001 13.18±0.49（10.35±0.34）a（9.72±1.18）a（10.53±0.94）a 14.188<0.001

2.4 创面愈合时间、瘢痕面积

创面愈合后，C 组愈合时间高于其他组，T+S 组愈合时间低于其他组；C 组瘢痕面积大于其他组，T+S组瘢痕面积小于其他组（P＜0.05）。见表4。

表4 4 组SD 大鼠创面愈合所需时间、瘢痕面积比较（±s）

表4 4 组SD 大鼠创面愈合所需时间、瘢痕面积比较（±s）

注：与 C 组比较，aP＜0.05；与 T 组比较，bP＜0.05；与 S 组比较，cP＜0.05

组别 创面愈合时间(d) 瘢痕面积(mm2)C 组(n=4)T 组(n=4)S 组(n=4)T+S 组(n=4)F 值P 值17.05±0.58（15.25±0.96）a（14.75±0.96）a（13.05±0.58）abc 17.867<0.001 25.25±3.78（17.00±1.41）a（17.50±1.29）a（13.25±2.36）abc 17.277<0.001

2.5 HE 染色分析

在第3 天，与C 组相比，其他组成纤维细胞数量较多，炎症细胞数量含量较少；在第7 天，各组均发现新生的毛细血管，并且T+S 组毛细血管的数量略高于其他组；在第10 天和创面愈合时，各组的成纤维细胞、 毛细血管和炎症细胞数量未见明显差异，见图1。

3 讨论

图1 各组大鼠在不同时间段皮肤组织学的变化(HE 染色，200X)

创面愈合是一个复杂过程，包括止血、炎症、增殖和重塑等阶段[4]。在炎症阶段，炎症细胞可以通过分泌生长因子和细胞因子参与创面愈合。GM-CSF 是一种多功能生长因子，若皮肤受到各种创伤时，GM-CSF的基因表达增强，参与到创面愈合的多个阶段[5-6]。在重塑阶段，成纤维细胞的数量会不断的升高，在细胞因子的调节下，胶原与细胞外基质不断翻转，最终形成瘢痕组织。瘢痕组织的形成是创面愈合的生理病理过程，实验证实白介素对瘢痕组织及创面愈合会产生一定影响，其中IL-1 可促进创面纤维化和瘢痕组织生成[7-8]。与 IL-1 不同，IL-10 是减少创面纤维化的重要因子[9]。酮咯酸氨丁三醇是一种非选择性COX 非甾体抗炎药，有实验证实[2]，给小鼠腹腔注射酮咯酸氨丁三醇可促进切口愈合，这可能与GM-CSF 浓度升高有关。IL-10 作为一种抗炎因子，酮咯酸氨丁三醇可增加其释放[10]。舒芬太尼是临床上常用的阿片类镇痛药，最新研究发现舒芬太尼可促进创面愈合，其促进创面愈合的机制可能是因为舒芬太尼对IL-10 的影响与酮咯酸氨丁三醇相似，可促进IL-10 的释放，降低应激反应，从而促进切口愈合[11-12]。

通过该实验可以看出，在第 3、7、10 天，T+S 组IL-1 的浓度 （104.56±16.63）pg/mL、（114.15±8.70）pg/mL、（114.90±6.07)pg/mL 低于 C 组 （132.67±9.56）pg/mL、 （150.51 ±9.11）pg/mL、 （156.75 ±4.71)pg/mL (P ＜0.05)，这表明酮咯酸氨丁三醇联合舒芬太尼可以抑制IL-1 的表达。在第 7 天和第 10 天，T+S 组 IL-10 的浓度（142.35±10.94）pg/mL、（176.70±7.08）pg/mL 高于 C组（112.07±10.15）pg/mL、（154.90±5.39)pg/mL 和 T 组（114.27±10.25）pg/mL、（126.73±13.79）pg/mL(P＜0.05)，这表明联合应用两种药物可以促进IL-10 的表达。在第 3 天，T 组 、S 组 及 T+S 组 、GM-CSF 值 （19.09±0.50）、（18.79±0.49）、（18.19±0.61)均高于 C 组(16.98±0.56)(P＜0.05)，这表明单独使用或联合使用酮咯酸氨丁三醇和舒芬太尼在第3 天左右GM-CSF 值到达高峰，C 组GM-CSF 值下降较为缓慢，这可能与C 组创面愈合时间有关。从愈合时间和瘢痕面积来看，T+S 组（13.05±0.58）d、（13.25±2.36)mm2优于 C 组 （17.05±0.58）d、（25.25±3.78）d、T 组 (15.25±0.96）d、（17.00±1.41)）mm2和 S 组 (14.75±0.96）d、（17.50±1.29)mm2（P＜0.05)，这表明舒芬太尼联合酮咯酸氨丁三醇的效果要优于单独使用，舒芬太尼联合酮咯酸氨丁三醇可以减少创面愈合后瘢痕面积，缩短创面愈合时间，并且从HE 染色来看，舒芬太尼联合酮咯酸氨丁三醇的组织学表现较好。这与张倩等学者[2]在研究中得出小鼠腹腔注射舒芬太尼和酮咯酸氨丁三醇，在第3、7 和10 天，与对照组[(0.191 4±0.002 3）、（0.173 7±0.001 2）、（0.082 9±0.002 6)相比 T+S 组[(0.384 4±0.018 2）、（0.343 3±0.002 1）、（0.104 0±0.009 8)]可提高 GMCSF 浓度(P＜0.05)，加快创面愈合这一结论相近，这充分体现了舒芬太尼联合酮咯酸氨丁三醇用于术后镇痛有利于术后创面的愈合。

综上所述，舒芬太尼联合酮咯酸氨丁三醇可以通过抑制IL-1 的表达、增强IL-10 和GM-CSF 的表达，使大鼠创面更快更好的愈合，减少了创面愈合后瘢痕面积。但是舒芬太尼和酮咯酸氨丁三醇联合使用是否会相互影响、联合应用促进伤口愈合的具体机制等问题目前仍不完全清楚，还需要不断深入的进行研究。