西藏地区13种虾脊兰植物花部表型及花粉形态特征研究

李洪池 吴天彧 弓 莉 罗 建

（1. 西藏农牧学院高原生态研究所，林芝 860000；2. 西藏高原森林生态教育部重点实验室，林芝 860000；3. 西藏林芝高山森林生态系统国家野外科学观测研究站，林芝 860000；4. 西藏农牧学院食品科学学院，林芝 860000；5. 西藏农牧学院资源与环境学院，林芝860000）

虾脊兰又称根节兰、海老根，为兰科（Orchida⁃ceae）虾脊兰属（Calanthe R.Br.）植物。因叶色浓密、株型美观；花朵颜色鲜艳，小巧玲珑、典雅清香，形态貌似小虾而得名。虾脊兰植物的整个花序叠加规则美观，在兰科植物中素有“兰中西施”的美称，具有极高的园艺观赏价值［1］。药用价值方面，虾脊兰植物中存在的生物碱等成分，具有抗炎、抗菌、抗毒素等作用，通常用来作为活血止痛、清热解毒的中草药使用［2］。近些年来，有关虾脊兰植物的研究主要集中在生理生化［3～4］、分子遗传［5～7］和新纪录发现上［8～9］。在分类鉴定方面的报道较少，传统的形态分类方法又具有一定的局限性，对于虾脊兰植物在系统分类上的问题，除了利用传统形态学等分类手段外，还需要增添更加细微的形态学特征研究。

植物器官具有各自特定的结构和功能，其形态特征也是植物分类鉴定最重要的依据之一。兰科作为单子叶植物中的第2大科，在形态结构和生活习性上变异多样，对研究植物多样性演化和区系地理分布具有重要科学价值［10］。虾脊兰植物是兰科植物中最具奇特花结构的植物类群之一，目前对于虾脊兰植物的分类鉴定也主要依靠花器官进行，其形态特征对于虾脊兰植物分类学意义上的重要性不言而喻。

西藏地区面积广阔，气候独特且复杂多样，具有多种气候类型。独特的自然地理条件，是其植被类型复杂，植物种类众多的重要原因［11］。据统计，西藏地区现有虾脊兰20种，包括近期新发现的新纪录3 种，在虾脊兰植物的研究上具有独特价值［12～15］。但关于西藏地区虾脊兰属植物的研究却只停留在新纪录的发现以及资源区系分布上，还没有更深层次的研究［16～17］。本文首次以西藏地区13 种虾脊兰植物（含2 种新纪录）的花部形态及花粉特征进行研究，为虾脊兰植物的分类鉴定提供新的研究依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验材料均来自于盛花期西藏地区野外采集虾脊兰植物13 个种的新鲜花朵，每个种随机选取正在开放的5朵花作为实验材料，个别种花朵较少只采集到2～3 份，共62 份。参考《中国植物志》［18］以及《西藏植物志》［12］等资料，确定植物来源及系统名称。实验材料详细信息见表1。

1.2 花部位表型测定

首先将野外采集好的13种虾脊兰植物新鲜花朵放置在解剖镜下对花朵的形态和颜色特征进行基本的观察，然后利用解剖针、尖头镊子等工具从花上进行萼片、花瓣、唇瓣、子房和合蕊柱等摘取分离，对其数量进行测定。之后用电子游标卡尺（精度0.01 mm）测量萼片、花瓣、唇瓣、柱头、子房等部位的长度和宽度；其中，长度为各部位基部至顶部的长度，宽度为各部位中部最大宽度。

1.3 花粉微形态观察

选取长势良好的花朵里花药，用镊子轻挑花药帽，取出里面的花粉块，放于培养皿中进行自然干燥。将自然风干后的花粉块用无水乙醇进行清洗后，把花粉块粘在贴有双面导电胶带的样品台上进行喷金镀膜，然后放入JCM-6000 型扫描电子显微镜中，加速电压选取5 kV，真空稳定后进行观察。先进行整体形态的全面扫描拍照，再观察局部5～6 个视野，选取具有普遍代表性的视野拍照，并保存清晰的花粉图片，用于分析花粉块表面纹饰等微形态特征。虾脊兰植物花粉微形态描述参考孙崇波等［19］和弓耀明［20］的花粉相关术语。

1.4 数据统计分析

利用电镜图片处理软件SMILE VIEW Stan⁃dard 对花粉块的长度、宽度进行测定。利用Excel 2016 数据分析软件对萼片、花瓣、唇瓣、花粉块等测量数据进行统计分析，并计算花部各部位和花粉块参数的平均值和标准差。采用单因素方差分析法，用SPSS19.0 软件对不同种和不同花部位长宽度指标的虾脊兰进行显著性差异分析，试验结果为平均值±标准差，P<0.05为显著水平。

表1 实验材料信息Table 1 Test information of materials

2 结果与分析

2.1 花部表型形态特征结果比较

观察的13 种虾脊兰在花的颜色上不尽相同，大致可分为以下4 种：黄色、黄绿色、黄褐色、粉红色，粉红色的花居多。其中，花粉红色有5种虾脊兰，分别为车前虾脊兰（C.plantaginea Lindl.）、反瓣虾脊兰（C.reflexa（Kuntze）Maxim.）、肾唇虾脊兰（C.brevicornu Lindl.）、长距虾脊兰（C.sylvatica（Thou.）Lindl.）和镰萼虾脊兰（C.puberula Lindl.）；黄色有4 种为：棒距虾脊兰（C.clavata Lindl.）、剑叶虾脊兰（C.davidii Franch.）、三棱虾脊兰（C.tricarinata Lindl.）和通麦虾脊兰（C.griffithii Lindl.）；黄绿色有3 种分别为：弧距虾脊兰（C.arcuata Rolfe）、无距虾脊兰（C.tsoongiana T.Tang et F.T.Wang）和西南虾脊兰（C.herbacea Lindl.）；黄褐色的只有1 种为细花虾脊兰（C.mannii Hook.f.）。在花部表型性状上，13 种虾脊兰植物每朵花都具总状花序，花序最短的为细花虾脊兰（C.mannii Hook.f.）只有5.3 cm，最长的为肾唇虾脊兰（C.brevicornu Lindl.）长达34.6 cm。13种虾脊兰每朵花的部位构成为：3 萼片、2 花瓣、1 唇瓣、1 合蕊柱。表明在花部位的整体构成上萼片、花瓣、唇瓣数量指标上没有明显的数量差异。说明虾脊兰植物在花部位的整体构成上已形成稳定性状，不能达到属种间分类鉴定的要求。

通过对这13种虾脊兰表型测定指标进行比较分析，花各部位（萼片、花瓣、唇瓣、子房、柱头）的长、宽度指标均表现出不同程度的差异，具体测量结果及差异性P 值比较结果见表2～3。结果表明：萼片长、花瓣宽、唇瓣宽和柱头长这4 个形态数据指标的差异性最大，各个种之间的P 值结果表现出显著性差异水平。说明这13 种虾脊兰在这4 个测定指标间存在丰富的变异，总体来看，萼片在平均长度和宽度上略大于花瓣、唇瓣等的平均长度和宽度。其中，萼片最长的为长距虾脊兰（18.57±0.026）mm，最短的为无距虾脊兰（6.14±0.024）mm，长距虾脊兰的萼片长显著高于剑叶虾脊兰、无距虾脊兰和细花虾脊兰，与其他种之间的萼片P 值比较结果也在显著水平；在花瓣宽度的测定指标上，最宽的为长距虾脊兰（9.62±0.047）mm，最窄的为细花虾脊兰（1.39±0.033）mm，剑叶虾脊兰、无距虾脊兰、细花虾脊兰和长距虾脊兰未达到差异显著性水平，但从测定结果数值上看花瓣的宽度测定指标在其余9种虾脊兰之间有极显著的差异；在唇瓣宽度的测定指标上，最宽的为三棱虾脊兰（12.49±0.122）mm，最窄的为无距虾脊兰（1.53±0.033）mm，只有车前虾脊兰和长距虾脊兰未达到显著性差异；在柱头长的测定指标上13 种虾脊兰均达到显著性差异，柱头最长的为通麦虾脊兰（7.73±0.031）mm，最短的为细花虾脊兰（2.23±0.021）mm。其余8个花部测定指标在不同虾脊兰品种间，也有不同程度的差异，但差异程度没有上述4个花部测定指标差异程度大，未达到显著性差异，各P值均大于0.05。

表2 13种虾脊兰各部位观察测量结果比较Table 2 Observation and measurement results compare of 10 species of shrimp spine orchid

表3 13种虾脊兰花部位及花粉块测定结果方差分析P值Table 3 The P value of analysis of variance for each part of 11 species

从花部表型观察测量结果来看，选取的这13种虾脊兰植物的花部形态测定指标在不同种间表现出丰富的差异性，表明虾脊兰花部形态特征可以作为虾脊兰植物分类的依据，在其系统分类上有重要指导作用。

2.2 虾脊兰花粉块整体形态特征

利用扫描电镜对这13种虾脊兰植物的花粉块整体形态特征进行了观察，可清晰地看到不同虾脊兰植物的花粉块在整体形态上的差异性和相似性。结果显示：这13 种虾脊兰植物的花粉块均由成千甚至上万粒形状极不规则的单粒花粉粒组成，每个花粉块成熟时会彼此分开，但会靠花粉黏盘轻微地连接在一起。而单粒花粉则十分紧密地粘合在一起，成熟后也绝不分离。有些虾脊兰植物的花粉粒之间可以看到有明显黏结物质以及花粉粒表面明显的小凹陷或小穴，在这13 种虾脊兰花粉块整体形态上未见到萌发孔结构。花粉块在形状上一般较长，一端偏大，一端较小（尖），大的一端呈三角形或三角状圆形。从整体形状上看，这13 种虾脊兰植物的花粉块整体形状多呈卵圆形（见图版Ⅰ：1，3～4、7，10～11）、长椭圆形（见图版Ⅰ：2，5～6）、梨形（见图版Ⅰ：8，12～13）。无距虾脊兰的花粉块在形状不规整，可能由于盛花期花粉块受到昆虫传粉破坏所致。从中也可看出这13种虾脊兰花粉块大小不一，其中长距虾脊兰（见图版Ⅰ：11）花粉块最大，棒距虾脊兰、反瓣虾脊兰和肾唇虾脊兰（见图版Ⅰ：1，3，7）次之，无距虾脊兰（见图版Ⅰ：9）花粉块最小且表面疏松。从花粉块的显著性差异P 值结果来看，这13 种虾脊兰在花粉块长宽度上差异不明显，也从侧面说明虾脊兰植物花粉微形态的分类学意义主要集中在表面形态和纹饰特征上。

2.3 花粉块表面微形态特征

2.3.1 花粉块表面形态结构特征

这13 种虾脊兰植物花粉块，外部表面上看都是由众多花粉粒堆积在一起构成，或横向、纵向排列，不同种的虾脊兰花粉块表面形态特征有所差异。棒距虾脊兰（见图版Ⅱ：1）的花粉块表面极不平整，各个花粉粒堆积在一起，花粉粒堆积间也不太紧密，在花粉粒连接处可以看到微小的缝隙。车前虾脊兰（见图版Ⅱ：2）花粉块表面较为光滑，花粉粒表面有轻微的隆起，各个花粉粒之间呈纵向排列，在花粉块的表面可看到小的凸起物，边缘有明显的阴影。此小凸起可能正是花粉的分泌物，对花粉粒有粘连作用。反瓣虾脊兰（见图版Ⅱ：3），花粉块表面非常平整光滑，花粉粒之间无明显粘连物，排列相对紧密，花粉呈不规则状态，花粉形状各不相同。花粉表面光滑，花粉粒衔接处无明显的粘结物。弧距虾脊兰和三棱虾脊兰（见图版Ⅱ：4，6）这2 种虾脊兰的花粉块表面形态结构相似，都是凹凸不平的状态。花粉粒之间堆积紧密，没有缝隙，且多个花粉粒的角端连接处可看到有一些类似胶状粘结物的点状突起。花粉粒的形状和表面纹饰也类似，从中也可看出两者的亲缘关系较近。剑叶虾脊兰和长距虾脊兰（见图版Ⅱ：5，11）这2 种虾脊兰表面平整但花粉粒表面有纹饰显现，不光滑。各个花粉粒之间的排列紧密，在花粉粒之间没有明显的粘连物，花粉粒形状也都为不规则的多边形。肾唇虾脊兰和细花虾脊兰（见图版Ⅱ：7，10），这2 种虾脊兰花粉块表面结构表面平整光滑，花粉粒表面有明显的纹饰特征，可以依稀看到细小的纹饰和类似孔状的结构，花粉粒之间也没有明显的粘连物。通麦虾脊兰和镰萼虾脊兰（见图版Ⅱ：8，12）的花粉块表面特征非常相似，花粉块及花粉粒表面均较为平整，花粉间排列紧密，但无挤压也没有缝隙。各个花粉粒的形状极不规则，排列杂乱。无距虾脊兰（见图版Ⅱ：9）花粉块表面凹凸不平，但表面光滑，无明显特征纹饰。花粉粒排列疏松，连接处可以看到有明显的缝隙，也没有粘连物。西南虾脊兰（见图版Ⅱ：13）的花粉块表面不平整，外表面的花粉粒上分布有明显的胶状粘结物。花粉粒呈不规则的多边形堆积，覆盖式排列在一起，花粉粒的表面也可以看到突起的点状物。

2.3.2 花粉粒表面纹饰特征

花粉粒表面纹饰是不同种兰科植物花粉的重要区别，通过扫描电镜观察结果表明：13种虾脊兰不同种的花粉粒表面纹饰特征颇有规律，而且各种间区别明显。根据花粉粒外壁表面纹饰特征可将这13种虾脊兰的花粉粒纹饰划分为4种类型：①花粉粒圆饼形表面呈凹陷型，花粉粒干瘪，略显光滑，棒距虾脊兰（见图版Ⅱ：1）为此类型；②花粉粒外壁表面呈光滑型，有突起或凹陷，无明显特征纹饰。具此类型花粉粒纹饰的种类有：车前虾脊兰、反瓣虾脊兰、通麦虾脊兰和无距虾脊兰（见图版Ⅱ：2～3，8～9）4 种；③花粉粒外壁有小孔状型的纹饰，不太明显。该类型的纹饰种类包括：弧距虾脊兰、三棱虾脊兰、细花虾脊兰和镰萼虾脊兰（见图版Ⅱ：4，6，10，12）4 种；④花粉粒外壁具穿孔型的纹饰，均匀大量的密布在花粉粒的表面，特征明显。具该类型花粉粒的种类包括：剑叶虾脊兰、肾唇虾脊兰、长距虾脊兰和西南虾脊兰（见图版Ⅱ：5，7，11，13）4种。

2.4 13种虾脊兰植物花部表型和花粉形态分种检索表

本研究依据所测定观察的花部表型形态及花粉微形态特征编写了这13种虾脊兰植物的分种检索表，结果如下。

基于花部表型和花粉形态的13种虾脊兰植物分种检索表

1.唇瓣深裂明显，花颜色为黄褐色………………………………………………………………………… 细花虾脊兰C.mannii

1.唇瓣裂度较浅，花颜色为黄色、黄绿色、粉红色

2.唇瓣无距，不明显成3裂，花粉红色

3.萼片长度在18 mm以上，花瓣宽度在9 mm以上………………………………………………… 长距虾脊兰C.sylvatica

3.萼片长度在18 mm以下，花瓣宽度在9 mm以下

4.花粉块整体形状为梨形………………………………………………………………………… 镰萼虾脊兰C.puberula

4.花粉块整体形状为卵圆形和长椭圆形

5.花粉粒表面光滑有明显纹饰特征 ………………………………………………………… 肾唇虾脊兰C.brevicornu

5.花粉粒表面光滑无明显纹饰特征

6.花粉粒表面有轻微隆起 ……………………………………………………………… 车前虾脊兰C.plantaginea

6.花粉粒表面平整无隆起 …………………………………………………………………… 反瓣虾脊兰C.reflexa

2.唇瓣明显3裂，花黄色、黄绿色

7.花粉粒形状为圆饼形 ……………………………………………………………………………… 棒距虾脊兰C.clavata

7.花粉粒形状为多边形

8.花粉粒连接处无明显的粘结

9.花粉粒表面平整光滑，排列紧密无缝隙 …………………………………………………… 通麦虾脊兰C.griffithii

9.花粉粒表面凹凸不平，排列疏松有缝隙…………………………………………………… 无距虾脊兰C.tsoongian

8.花粉粒连接处有明显的粘结物

10.花粉粒外壁有依稀可见的孔状纹饰

10.花粉粒外壁均匀密布大量的孔状纹饰……………………………………………………… 剑叶虾脊兰C.davidii

11.唇瓣较宽，花粉粒外壁具明显的小孔状纹饰………………………………………… 三棱虾脊兰C.tricarinata

11.唇瓣较窄，花粉粒外壁具明显的小孔状纹饰

12.花粉粒无覆盖排列在一起，表面无突起的点状物 …………………………………… 弧距虾脊兰C.arcuata

12.花粉粒覆盖式排列在一起，表面有突起的点状物………………………………………… 西南虾脊兰C.herbacea

3 讨论

3.1 13 种虾脊兰花部表型及花粉形态特征的生物学意义

兰科植物花部类型复杂，花粉块及花粉粒在形态结构特征上呈现多样化。虾脊兰属植物为两性花，其花色浓郁艳丽，这是其生殖阶段对传粉昆虫的诱因之一。研究的13种虾脊兰的花部构成都为：3 萼片、2 花瓣、1 唇瓣、1 子房、1 合蕊柱。在花部表型结构上虾脊兰植物有1 个花瓣特立演化为唇瓣，唇瓣结构的形成可为传粉昆虫提供立足的平台［21］，有利于昆虫更直接地接触到花药并将花粉块带走，提高虾脊兰传粉效率。萼片和花瓣在生物学意义上，则主要依靠其颜色和气味对传粉昆虫起到吸引作用。虾脊兰植物的合蕊柱是由雄蕊、花柱和柱头联合生成的复合器官，合蕊柱的形成使得花药、花粉块能够有附着的生长结构。在实验中还发现合蕊柱表面会分泌一种浅黄色液体，有利于花粉块附着在柱头上，也为后期昆虫进行花粉传播提供了便利。从观察的这13种虾脊兰的花部整体构成上看，虾脊兰植物的花部特征显现出一定的生物学意义，使得虾脊兰植物在自然环境条件下也能够有正常的生长发育并结果。在花粉形态特征上，13 种虾脊兰的花粉粒都会粘连形成花粉块［22］。自然条件下，杓兰属植物繁殖能力差，种群数量较少。花粉粒粘连成块这是虾脊兰植物在生物学意义上的适应性表现，也是与其他兰科植物花粉相比的特征之一。在这13种虾脊兰植物花粉形态的扫描观察中，均未看到有萌发孔出现。在个别种类的虾脊兰花粉表面可以看到有明显的孔状纹饰，推测这些小孔有帮助虾脊兰花粉萌发的作用。这13种虾脊兰的花部表型及花粉形态的适应性特征也是为了在生物学上能更好地繁殖传播。

3.2 13 种虾脊兰花部表型及花粉形态特征的分类学意义

从花部表型观察结果来看，这13 种虾脊兰的花部构成，萼片、花瓣、唇瓣等结构的数量性状没有明显的数量差异。而花各部位萼片、花瓣等的长、宽度测量结果在数值性状上确有明显的大小差异，根据这些花部位测量结果的显著性差异P值结果分析，萼片长、花瓣宽、唇瓣宽和柱头长这4个测量指标在不同种之间存在显著性差异。不同种之间数值相差较大，利用这一测量特性可以对此次研究的这13种虾脊兰进行初步的分类。其余部位的花部测量指标在不同虾脊兰种间，也有差异，但差异程度没有上述4个花部测定指标差异程度大，未达到显著性水平。

花粉是种子植物成熟植株的雄性生殖细胞，主要受遗传因素的影响，环境条件影响较小。不同植物种类的花粉均能形成既稳定又保守的独特形态特征，因此可以为植物系统进化、分类鉴定以及亲缘关系研究等方面提供有力的依据［23］。通过对这13 种虾脊兰植物花粉块整体形态、表面特征和花粉粒纹饰观察分析，发现其花粉形态特征多样化，但种间又有共同点。整个花粉块形状、花粉粒表面结构及外壁纹饰有较大的差异，未见明显的萌发孔，根据这些形态特征的差异可以初步对其进行分类及亲缘关系的评判。

这13种虾脊兰中只有棒距虾脊兰为虾脊兰属（Calanthe R.Br.）落苞组（Sect.Styloglossum）植物，其余12 种虾脊兰都为虾脊兰组（Sect.Calanthe）植物。在花粉形态特征上棒距虾脊兰与其他12种虾脊兰明显不同，棒距虾脊兰花粉粒呈圆饼状，表面有凹陷；其余12 种虾脊兰的花粉粒多为不规则的多边形，表面光滑或有孔状纹饰。虾脊兰组的12种虾脊兰的花粉形态特征差异也表现出明显的差异，不同种间也有相似性。从花粉块整体、表面形态和花粉粒表面纹饰综合分析，剑叶虾脊兰、长距虾脊兰和西南虾脊兰最为相似；这3种虾脊兰花粉块表面都较为平整，花粉粒形状也都为不规则的多边形，花粉粒表面都有穿孔状纹饰，可以推断这3种虾脊兰具有较近的亲缘关系。其余9种虾脊兰在花粉块形态特征、表面结构和花粉粒外部纹饰上差异性较大，较为明显。本次观察的这13 种虾脊兰植物虽然仅占整个兰科植物的极小部分，但从花部表型和花粉特征上可以对其进行种间分类。虽未能达到具体各个种之间的详细分类，但对这13种虾脊兰亲缘关系的确定有补充作用，要想对其进行更深层次的研究还应该结合遗传学、分子生物学等方面的研究结果进行全面的分析和总结。