山西省猪呼吸道疾病综合征病原感染状况调查

王 晨，孟玉凯，高 宇，岳伟东，张 甜，朱东阳，马海利

（山西农业大学动物医学学院，山西太谷030801）

目前，除非洲猪瘟等烈性传染病外，影响养猪业健康发展的主要疾病有呼吸道疾病、消化道疾病和繁殖障碍性疾病，其中，以猪呼吸道疾病危害最为严重[1]。引起猪呼吸道疾病的因素很多，主要包括细菌、病毒、支原体等病原体和不良饲养管理因素等[2]。由猪肺炎支原体（MHP）与多杀性巴氏杆菌（PM）、猪链球菌（SS）、副猪嗜血杆菌（HP）或猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）等呼吸道致病菌混合感染引起的肺炎称猪地方性肺炎（Swine enzootic pneumonia）[3]。由猪肺炎支原体（MHP）与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2 型（PCV2）、猪流感病毒（SIV）等呼吸道病毒混合感染引起的呼吸道疾病称为猪呼吸道疾病综合征（Porcine Respiratory Disease Complex，PRDC）[3]。

PRDC 主要发生于6～10 周龄的保育猪和13～20 周龄的育肥猪，患病猪主要表现为体温升高（40 ℃以上）、食欲降低、结膜炎、呼吸困难、咳嗽、喘气等，发病率为25%～60%，病死率为20%～90%[4]。保育猪周龄越小死亡率越高，育肥猪死亡率低，但生长发育迟缓，饲料转化率降低，给养猪业带来了很大的经济损失。我国的广西、福建、黑龙江等省均报道了该病的发生[5-7]，目前山西省内PRDC 的感染状况尚不明确。

为了调查山西省猪群中猪呼吸道疾病综合征（PRDC） 的感染状况，本研究利用PCR 技术对2019 年6—7 月采自山西省11 个市20 个规模化屠宰场的521 份猪肺组织样品进行了PRDC 病原基因检测，旨在为山西省防控PRDC 提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 样品来源

521 份猪肺组织样品于2019 年6—7 月采自山西省11 个市20 个规模化屠宰场，询问、记录生猪来源，并向当地动物疫控部门及相应的养殖场了解疫苗免疫接种情况。

1.2 主要试剂

DNA 提取试剂盒购自北京聚合美公司；RNA提取试剂盒购自天根生物科技公司；RNA 反转录试剂盒购自南京诺维赞生物科技有限公司。

1.3 引物合成

检测MHP、PRRSV、PCV2、PCV3、SIV 基因的特异性引物序列源自相关参考文献，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。所用引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.4 猪肺组织样品的PCR 扩增

无菌操作取一小块肺组织放入灭菌的研钵中，加入液氮进行研磨后，分别装入2 个EP 管，利用试剂盒提取样品总DNA 或RNA，并将提取的RNA经试剂盒反转录为cDNA。

利用不同病原体特异性引物并优化相应扩增条件[8-12]，对提取的521 份核酸样品进行MHP、PRRSV、PCV2、PCV3、SIV 基因PCR 扩增，PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR 扩增目的片段的有无、大小确定检测结果。

2 结果与分析

2.1 猪肺组织样品中不同病原体PCR 检测结果

将猪肺组织样品提取的DNA 分别利用MHP、PCV2、PCV3 特异的鉴定引物进行PCR 扩增，同时将肺组织样品提取的RNA 反转录后分别利用PRRSV、SIV 特异鉴定引物进行扩增，部分样品电泳结果如图1、2 所示，利用针对不同病原体的鉴别引物可以扩增出MHP、PCV2、PCV3 预期目的片段，但未扩增出SIV。选取部分PCR 扩增产物胶回收后进行测序验证，测序结果在NCBI 核酸数据库中进行Blast 比对均为相应的病原体，因此，建立的PCR 鉴别方法可以用来区分不同病原体。

将山西省不同地区采集的521 份猪肺组织样品分别利用针对猪呼吸系统综合征不同病原体的鉴定引物进行检测，结果发现，山西省不同地市采集的猪肺脏样品中MHP 阳性率很高，为76.9%。另外，猪圆环病毒PCV2 及PCV3 的阳性率也较高，分别为61.6%和85.2%（表2）。经向相应地市动物疫控部门、猪养殖场管理人员进行了解调查，发现当地猪肺炎支原体（MHP）及猪圆环病毒（PCV2）的免疫接种率很低，很多农户及大型养殖场均未曾免疫上述疫苗，因此，MHP 和PCV2 的阳性率较高。

表2 猪肺组织样品PRDC 病原检测结果

2.2 山西省不同地区PRDC 的病原检测分析

山西省11 个市MHP 阳性率均在50%以上（表3），其中，阳泉市MHP 阳性率相对较低，为50%，各市单一MHP 感染阳性率均较低，多为混合感染，各市间无显著差异，说明山西省各地MHP 感染较为严重，且以混合感染为主。由MHP 与病毒混合感染情况分析（表3）可知，大同市MHP＋PVC3 的阳性率较高，为43.4%，忻州市、长治市、运城市MHP＋PCV2＋PCV3 的阳性率均在56.4%以上，极显著高于其他地市（P＜0.01）。MHP＋PCV2 ＋PCV3 ＋PRRSV 四重混合感染阳性率为6.1%，其中，晋城市阳性率较高，为30.2%，极显著高于其他10 个地市（P＜0.01）。昼夜温差变化、养殖环境等不良因素都容易诱发猪群的猪呼吸系统综合征，不同市养殖场的饲养管理水平和疫苗接种率不同，是造成PRDC感染率差异的主要原因。

表3 各市猪肺组织PRDC 病原检测结果

2.3 山西省不同模式养猪场PRDC 的病原检测分析

20 个规模化屠宰场中，14 个屠宰场的生猪来源于规模化养猪场，6 个屠宰场的生猪来源于当地散养户。由2 种养殖模式猪场PRDC 的病原检测结果分析（表4）可知，2 种养殖模式下MHP 的阳性率均高于70%，但散养户MHP 的阳性率为86.0%，高于规模化养猪场。

在猪肺炎支原体与病毒混合感染样品中，散养户MHP＋PCV2 的阳性率为8.9%，稍高于规模化养猪场；规模化养猪场MHP＋PCV3 的阳性率为26.3%，显著高于散养户；散养户MHP＋PCV2＋PCV3及MHP＋PCV2＋PCV3＋PRRSV 的阳性率分别为48.6%、12.3%，均极显著高于规模化养猪场。由此可知，散养户由于养殖条件及生物安全防护不足等原因导致猪呼吸系统综合征病原体的阳性率均高于规模化养猪场。

表4 不同养殖模式猪肺组织PRDC 病原检测分析

3 结论与讨论

本研究检测的猪肺脏组织样品采自山西省全省11 个市的20 个屠宰场，样品来源涵盖山西省所有地市。受非洲猪瘟期间生猪调运政策的限制，屠宰场生猪来源多为本地养猪场，即采集的样品具有一定的代表性。

山西省11 个市均可检出MHP 阳性样品，此次样品采集的20 个屠宰场的生猪来源中，80%以上的养殖场及养殖户均未免疫猪肺炎支原体弱毒苗，即MHP 利用PCR 检测阳性具有参考价值。山西全省样品中MHP 的阳性率为76.9%，结果与李莹莹[13]、邱刚等[14]报道相符。各市MHP 感染率均在50%以上，根据生猪出栏时间推测，可能与春季整体上昼夜温差变化较大，造成猪群抵抗力下降，更容易诱发呼吸道感染有关。401 份MHP 阳性样品中389 份为混合感染，该结果提示MHP 是引起猪呼吸道疾病综合征的重要诱发病原。单一MHP 感染主要引起猪的慢性肺炎，并不表现出明显的症状；当MHP与PCV2、PRRSV、SIV 等混合感染时才会引起猪呼吸道疾病综合征[15]。主要是由于MHP 进入呼吸道后，破坏宿主的黏膜纤毛屏障，引起呼吸道纤毛屏障系统功能减退，从而继发其他病原的感染[16]。

山西省11 个市均检出PCV2，阳性检出率为61.6%，刘秀清等[17]对西宁市部分地区进行PCV2 流行病学调查，阳性率为49.94%，曹启明等[18]对江苏地区PCV2 进行流行病学调查发现，PCV2 阳性率为50%，表明我国的PCV2 感染仍然较为严重。此次检出的321 份PCV2 阳性样品中，269 份均为混合感染，这与PCV2 病毒可导致猪的淋巴系统功能衰竭和免疫抑制有关。因此，猪感染PCV2 后，容易继发其他病原的感染。PCV2＋PCV3 混合感染有较高的检出率，与李金凤等[19]、ZHAO 等[20]研究结果一致，推测PCV2、PCV3 之间存在某种相互作用机制，促使病毒在体内增殖。

山西省11 个市PCV3 阳性检出率为85.2%，原因可能是由于目前市场上尚无良好的PCV3 疫苗用于临床预防，现有的PCV2 商品化疫苗对PCV3无交叉免疫保护作用，所以，PCV3 的阳性检出率较高，且呈逐年上升的趋势。截止目前，尚未分离培养出PCV3 病毒，现有研究仅证明PCV3 可能和猪皮炎与肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征、繁殖障碍综合征等病症相关[21-22]，其作用机制、发病症状、产生的直接危害尚缺少数据支持。SIV 未检出阳性样品，这可能与采样季节有关，猪流感易于冬春季节、天气骤变等不良环境下多发。