枇杷ISSR分子标记的研究进展

刘小英，黄飞龙，刘国强，张游南

（福建省莆田市农业科学研究所，福建莆田 351144）

0 引言

枇杷(Eriobotrya japonicaLindl.)，蔷薇科枇杷属植物，原产中国东南部，野生种质资源极为丰富[1]。枇杷成熟于一年中最缺新鲜水果的春夏时节，正值鲜果淡季，其果实营养风味佳，果肉酸甜可口，富含钙、磷、钾、氨基酸、胡萝卜素等，可鲜食也可制成果脯、果酱、果酒及饮料等，其花、果、叶和根均可入药，具止咳润肺、清热健胃等功效，从而深受消费者青睐。随着枇杷育种研究工作的不断深入，常规育种技术难以取得较大突破，分子辅助育种应运而生，推动了枇杷育种研究的进程。目前果树上常用的分子标记类型有RFLP、RAPD、ISSR、AFLP、SSR等[2-4]。ISSR是非常有发展前途的分子标记，引物可以在不同物种间通用，开发成本低；克服了RAPD和RFLP许多局限性，结合了RAPD和SSR技术的优点，揭示的多态性较高，已广泛应用于植物品种鉴定、基因定位、遗传多样性、遗传作图、进化及分子生态学研究中[5-9]。

近年来，基于ISSR技术的枇杷分子标记主要集中在种质鉴定、遗传多样性分析、遗传变异分析、枇杷分类研究及指纹图谱构建等研究方面的应用。本文归纳总结前人研究成果，发现ISSR技术以其独特的优越性在枇杷育种研究中得到不断发展，但研究的深度不够，广度不足。功能基因的挖掘，重要农艺性状的QTL分析及标准指纹图谱库的建立等深层次研究未见报道，已报道的研究也存在供试样本量少、电泳技术落后等问题。因而笔者通过总结思考，指出存在的主要问题，提出解决的若干意见，以期为枇杷育种工作提供参考。

1 ISSR技术原理及优缺点

ISSR(inter-simple sequence repeat)是1994年Zietkeiwitcz等[10]在SSR基础上发展起来的一种新的分子标记。原理是根据生物广泛存在SSR的特点，利用SSR本身设计引物，即在SSR序列的3’端或5’端加上2～4个随机核苷酸，扩增重复序列之间的基因组片段，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。ISSR标记的优点包括：操作简单、快速、高效；采用通用引物进行扩增，无需DNA测序和引物设计等；引物专一性较强，实验重复性较高；结合了RAPD和SSR的优点，产物多态性丰富；呈孟德尔式遗传。从而被广泛应用于杏[11-12]、梨[13-14]、葡萄[15-16]、芒果[17-21]、香蕉[22-26]等果树遗传育种中。ISSR标记的不足包括：需要一定时间优化实验PCR条件，来获得清晰、可重复、易统计的条带；ISSR是一种多基因位点技术，为显性遗传标记，无法区分显性纯合基因型和杂合基因型。

2 ISSR技术在枇杷上的研究现状

2.1 枇杷的种质鉴定、遗传变异分析

中国枇杷种质资源丰富，各地之间互相引种栽培，再通过实生育种、芽变育种、杂交育种等形式选育品种，故而枇杷“同名异物或同物异名”的现象时有发生。目前果树种质鉴定的方法，传统方法主要有形态学鉴定法，生化鉴定法、细胞核型分析等。传统方法具有存在信息量少、取材部位有限、无法进行早期鉴定，存在鉴定人为因素影响等局限性。随着分子生物技术的快速发展，果树种质鉴定由宏观走向微观，由复杂费时向快速简便发展。ISSR是重要的分子标记技术，能从分子水平揭示比较材料基因水平上的差异，因而越来越多地被用于果树种质鉴定工作。盛良明[27]鉴定了白沙枇杷优良新株系‘苏白1号’，结果表明其与‘冠玉’和‘青种’的亲缘关系较近；章镇等[28]根据ISSR亲缘分析，推测‘冠玉’是‘白玉’和‘田中’的杂交种；赵依杰等[29]鉴定了‘东湖早’，结果表明‘东湖早’与‘太湖4号’相似系数最大；福建省农科院选育的优质白肉新品种‘贵妃’、‘新白1号’和‘新白8号’形态学上相似度高，难以分辨，谢丽雪等[30]利用ISSR技术获得可以区分三者的特异谱带。物种的遗传多样性是长期进化的结果，也是其生存和发展的前提，物种群体间的遗传多样性越丰富，遗传变异越多，其对环境的适应性越强，群体的分布范围越容易扩大[31]。ISSR技术能提供较多的DNA片段，可扫描基因组内的多态位点，是分析不同个体、种群、物种间遗传差异的理想标记。不少学者也采用ISSR分子标记方法分析枇杷的遗传变异。‘川早枇杷’是‘早钟6号’的芽变新品系，梅洛银等[32]通过对13个枇杷品种（品系）进行ISSR分析，认为‘川早枇杷’在遗传物质上发生了变异，具备成为枇杷新品种的条件；汪卫星[33]以‘解放钟’四倍体为母本、‘湖南早熟’二倍体为父本进行有性杂交，对6个天然三倍体枇杷及其母本进行ISSR分析，结果推测三倍体基因组可能主要来源于母本；孙淑霞[34]采用ISSR分子标记探索与枇杷果肉色泽深浅有关的分子标记及其特异片段，获得2条差异片段，但获得的特异片段克隆测序分析与已知色素基因没有同源性，具体原因有待进一步深入研究；韩雪平等[35]运用ISSR分子标记对7份供试材料的抗寒性进行分析鉴定，除最抗寒的‘6-3-10’植株外，找到一条其他6份材料中能稳定表达的特异条带UBC857-600bp；杨芩等[36]采用ISSR分子标记对‘龙泉1号’、‘龙泉5号’、‘大五星’及其退化种子株系进行遗传多样性分析，结果从分子水平进一步证实了枇杷退化种子株系已形成丰富的遗传变异，遗传背景高度复杂，是培育枇杷新品种的宝贵中间材料；杜奎等[37]以南亚枇杷与‘大五星’枇杷，南亚枇杷与4-1-5枇杷正反交真杂种为试材，综合ISSR分析和形态学鉴定，杂交子代中个体发育形成丰富遗传变异；张蒙蒙[38]探讨EMS对枇杷潜伏芽的诱变效果，通过ISSR分析，认为EMS处理扩大了枇杷芽变的突变范围，提高枇杷潜伏芽的基因突变频率；刘丹等[39]以枇杷‘白玉’品种及其无籽芽变、‘冠玉’品种及其辐射变异为试材，通过ISSR研究发现两种变异不是单一位点上的变异，而是发生在多个位点上，且实生变异＞辐射变异＞自然芽变；李靖[40]分析了在四川省阿坝州茂县发现的变异植株，结果野生型和突变型之间多态性片段极少，DNA基因组背景几乎一致，从分子水平证明突变型是野生型的芽变枝，并通过ISSR标记找出野生型和突变型的差异片段，从分子水平为选育枇杷提供参考。

2.2 枇杷属植物的分类研究

研究枇杷属植物的分类、类群关系及系统演化，对枇杷属植物的资源保护、遗传改良和创新利用，以及新品种的培育等均具有重要意义。ISSR标记研究枇杷属植物的分类研究报道较少。四川农业大学的王永清团队采用ISSR分子标记技术对枇杷的分类研究结论如下：枇杷属植物具有较丰富的遗传多样性；枇杷属植物春季或秋冬季开花品种间无特异标记，认为不能以开花时期作为分类的依据；枇杷属植物分野生类群和栽培类群，栽培类群不能按单一性状聚类，因而认为栽培品种的分类应考虑多个性状的综合表现；支持大渡河枇杷是栎叶枇杷和普通枇杷种间杂种的结论[41-46]。按自然地理来源也是枇杷属植物传统的分类方法，但谢丽雪和范付华的ISSR标记都表明，枇杷的亲缘关系与地理来源相关性不明显。谢丽雪等[30]对24份白肉枇杷进行ISSR技术分析，可能与枇杷栽培历史长、各地区种质的频繁交流、长期异花授粉、变异性高等有关，供试白肉枇杷的亲缘关系与地理来源相关性不明显；范付华[47]对贵州39份野生枇杷种质进行ISSR技术分析，聚类结果表明与种质表型相关，与地理来源相关性不明显。按果肉颜色分类，枇杷可分为红沙枇杷和白沙枇杷两大类，而范晨昕[48]的枇杷ISSR聚类研究结果显示，聚类结果与果肉颜色相关性不明显。

2.3 枇杷的指纹图谱构建

指纹图谱是研究动植物群体生态与进化、遗传结构、品种分类等很有价值的遗传标记。枇杷指纹图谱的构建是枇杷种质鉴定、新品种权保护和杂交育种的重要“分子身份证”。目前枇杷的指纹图谱构建报道较少，已报道也是在有限的材料基础上初步完成。He等[49]利用ISSR标记构建了‘西昌早熟’、‘早钟6号’、‘湖南早熟’（湖南样本、重庆样本）、‘兴宁1号’5个早熟枇杷品种（系）的指纹图谱，；范付华等[47,50]采用ISSR标记，应用引物815、825和841的组合，构建了39份贵州野生枇杷种质的指纹图谱，应用引物825、834和848的组合，构建了18个枇杷栽培品种及课题组选育的7个优良新种质的指纹图谱；谢丽雪等[51]应用SSR、SRAP、ISSR标记技术，以枇杷‘早钟6号’和‘贵妃’杂交的56株F1代群体为供试材料，初步构建了含94个遗传标记（其中ISSR贡献标记28个），19个连锁群的枇杷遗传连锁图谱。

3 展望

近年来，随着人类对微观世界的不断探索，分子标记技术成为人类研究植物的重要技术手段。理想的分子标记应满足高多态性、呈共显性遗传、均匀分布整个基因组、能辨别等位基因、无基因多效性，且技术的开发使用成本低、检测手段简单高效、实验室间可数据交换等条件。但目前已开发的分子标记技术，无论是基于DNA杂交技术的分子标记，基于PCR技术的分子标记，或是新兴的第3代分子标记，即基于DNA芯片技术的分子标记，尚不能完全满足上述要求。因而除了不断开发新的分子标记，如何高效应用现有的技术手段服务于学科发展也是重要课题。因此，ISSR技术在枇杷上的应用研究还需持续深化优化，笔者认为应重点加强以下几个方面的工作。

（1）提高ISSR技术自身的准确性。ISSR标记技术用于枇杷种质鉴定、枇杷分类研究及枇杷指纹图谱的构建，都是各研究团队在自身设定的供试样本里进行，因而如何在更大供试样本范围内建立种质特异的指纹图谱，亟待进一步研究。其次，已报道的枇杷ISSR标记技术研究，均采用琼脂糖凝胶电泳检测，由于条带较多且有些条带大小近似，从而影响鉴别结果，如何提供灵敏度强、分辨率高、误差小的电泳技术，是今后需要不断研究的课题。

（2）延伸ISSR技术在枇杷上的研究深度和广度。参照ISSR在其他领域的研究，促进ISSR技术在枇杷育种研究上的“深度推进”和“广度普及”，重点加强三方面研究：一是利用ISSR分子标记实现杂种优势预测，缩短育种年限，提高育种质量；二是利用ISSR标记对种质资源进行遗传多样性分析，确定遗传距离，弄清系谱关系，结合表型鉴定，做好枇杷分类工作；三是增加ISSR标记位点数量，提高枇杷指纹图谱的密度及均匀度，从而保护枇杷品种产权，提高枇杷种苗纯度。

（3）加强ISSR技术的联合应用。一是与其他标记技术的联合应用。如王明强等采用ISSR-SCAR分子标记快速筛选高苍术含量的植株[52]，黄艺宁采用RAPD、ISSR分子标记联合鉴定毛木耳菌株的研究[53]。ISSR与其他标记技术的联合应用，能更准确揭示试验结果。二是结合表型分析的联合应用。分子标记体现材料DNA水平的变异，但标记不同、引物不同、反应条件不同，会引起结果误差。表型是基因与环境互作表达结果，是种质资源研究的基础。因而ISSR技术与表型分析联合应用，将达到更好的效果。

（4）加强科技协作，促进合作交流。目前国内关于枇杷的ISSR研究比较分散，各研究团队之间的合作交流较少，得出的研究成果结果可比性较差，因而构建合作研究蓝图，形成统一规划机制，利用现代信息技术实现资源共享，将在一定程度上加快ISSR技术在枇杷育种领域的研究。