全氟与多氟烷基物质的生殖毒性研究进展

张善宇，姚谦，施蓉，田英

上海交通大学公共卫生学院环境与健康系，上海 200025

全氟与多氟烷基物质（per- and polyfluoroalkyl substances，PFAS）是一类由氟原子和特定官能团结合在碳链骨架上所构成的人造有机化合物，化学性质稳定，被广泛应用于工业生产，因此在水、空气、土壤等多种环境介质中均有检出。PFAS 半衰期长，容易在生物体内蓄积，产生多种毒性作用，其中全氟辛烷磺酸（perfluorooctane sulfonate，PFOS）、全氟辛酸（perfluorooctanoic acid，PFOA）、全氟壬酸（perfluorononanoic acid，PFNA）在环境中约占PFAS 总含量的80%，有较强的生物活性，也是研究最多的物质。从2008年开始，欧盟、日本、美国相继制定了有关PFAS 使用的相关标准，美国于2015年全面淘汰PFOA，但PFOA的全球产量仍逐年攀升，中国也是全球PFAS 的主要生产地之一。近年来，多项研究发现人群生育力下降与环境有害物质暴露有直接联系，人群和动物研究也发现PFAS 暴露与不良生殖状态有关，因此，综述PFAS 的生殖毒性对于进一步了解其毒性效应，以及深入探索其毒性机制有重要的意义。

1 PFAS污染现状与人群暴露特征

PFAS 性质稳定，迁移能力强，已在世界各处的多种环境介质中广泛检出。由于PFAS 的碳链越短，水溶性越强，所以在水体中，短链PFAS 的含量较高，如全氟丁烷磺酸盐（perfluorobutane sulfonate，PFBS）和全氟丁酸（perfluorobutyric acid，PFBA）。阿姆斯特丹的环境水样中，PFBA 和PFBS 质量浓度（后称浓度）的算术均数分别为33、35 ng·L-1，且较难通过水处理工艺去除。美国一个PFAS 工厂附近的河流中，总PFAS 浓度均值达到1 863 ng·L-1，主要污染物是全氟-2-（全氟甲氧基）丙酸和六氟环氧丙烷二聚酸［1］。在空气中，Yao等［2］在天津收集了不同场所（如酒店、电影院等）的室内空气和灰尘，检测发现主要PFAS 为含氟调聚物醇，由此估计人体每天通过空气吸入和粉尘吸入的总PFAS 质量分数分别为1.04～14.1、0.10～8.17 ng·kg-1。此外，PFAS 容易在土壤中蓄积，以垃圾填埋场和氟化物工厂附近的土壤污染最为严重［3］。PFAS 可以通过土壤向农作物迁移，研究人员用含PFAS 的土壤种植玉米，发现玉米秸秆和玉米中的PFAS 浓度均大幅升高［4］，其他植物中也均有不同程度的PFAS 检出［3］。由此可见，人群会多途径暴露于PFAS，带来严重的健康威胁。

人血液、尿液、精液、卵泡液、指甲、头发等生物样本中均能检出PFAS。PFAS 代谢转化缓慢，不易排出体外，因此血液是常用的检测PFAS 的生物样本。但由于短链的替代物水溶性增加，更有利于排出体外，所以尿液可能是未来检测短链PFAS 的更好的样本。不同地区的人群之间PFAS 暴露水平差异较大，西方国家主要以PFOS 暴露为主，而中国上海和山东以PFOA高暴露为特点［5］。男性的PFAS 暴露水平比女性高［6］，母亲体内的PFAS 还可以通过胎盘和母乳进入新生儿体内，对新生儿的生长发育造成影响［5］。目前用于工业生产的PFAS 已多达千种，但能够被实验室检测到的PFAS 不到百种，因此持续关注这一类物质的影响尤为重要。

2 PFAS 的雌性生殖毒性

2.1 PFAS对女性生殖功能影响的流行病学研究

PFAS 暴露与女性生育力降低，卵巢疾病的发生风险增加有关。加拿大一项大样本队列研究发现，血浆中的PFOA 和全氟己烷磺酸（perfluorohexane sulfonic acid，PFHxS）浓度每增加1 个标准差，生育力就会降低11%和9%，不孕的风险增加31%和27%，而PFOS则没有明显的相关性［7］。Wang 等［8］对180 例因多囊卵巢综合征而不孕的女性进行病例对照研究，发现全氟十二酸（perfluorododecanoic acid，PFDoA）血浆浓度与多囊卵巢综合征相关的不孕风险增加有关。Zhang 等［9］在原发性卵巢功能不全的病例对照研究中也发现，暴露于PFOA、PFOS 和PFHxS 与女性发生原发性卵巢功能不全风险增加有关。

女性的生殖功能与卵巢状态息息相关，而女性的月经周期是卵巢状态的直接体现。PFAS 与月经周期紊乱有关，如初潮时间推迟，月经量减少，周期时间延长等。美国俄亥俄州的一项2 931 名8～18 岁女性的横断面研究发现，PFOA和PFOS高暴露女性比低暴露女性的月经初潮时间分别延迟了130、138 d［10］。丹麦的出生队列研究发现，宫内PFOA 高暴露组比低暴露组月经初潮时间推迟5.3月，但PFOS 则无类似发现［11］。但是，英国一项巢式病例对照研究发现初潮年龄提前与接触PFAS 没有关联［12］。此外，PFAS 还与月经周期不正常有关。Lyngsø 等［13］对格陵兰、波兰、乌克兰共1 623 名女性研究发现：PFOA 高暴露与更长的月经周期有关。随后，Zhou 等［14］在上海的横断面研究（950 名女性）发现，PFOA、PFOS、PFNA、PFHxS暴露与月经周期不规律、更长以及月经量减少有关。对美国国家健康和营养调查参与者的研究发现，较高的PFAS 浓度与更年期提前有关，与血清中PFHxS 低浓度组的女性相比，中浓度组和高浓度组的自然绝经风险是其1.42 倍和1.70 倍［15］。八碳健康项目中的42～65 岁女性绝经的风险随着PFOA 和PFOS 水平的增加而增加［16］。但Dhingra 等［17］采用回顾性队列，研究了2005—2006年招募的女性，发现PFOA 暴露与更年期提前之间无关联。

女性的卵巢状态受到性激素的直接调控，PFAS作为环境内分泌干扰物，对性激素有明显的影响。八碳健康项目显示PFOS 暴露与42～65 岁没有使用避孕药历史的女性血清中雌二醇（estradiol，E2）水平呈负相关［16］；挪威的一项横断面研究在25～35 岁健康且未孕的女性中发现，血清PFOS 水平与血清E2和孕酮（progesterone，P4）水平呈负相关［18］。同样地，Zhang等［9］发现PFOS 暴露可能会导致原发性卵巢功能不全病人的E2和催乳素水平降低，卵泡刺激素（folliclestimulating hormone，FSH）水平增加。Mccoy 等［19］在50 名进行辅助生殖的女性体内发现PFOS 浓度与E2水平呈负相关。此外，Heffernan 等［20］在无多囊卵巢综合征的健康女性中观察到，PFOS 暴露与游离雄激素指数呈负相关。然而，上述研究中均未观察到PFOA与性激素水平的关联。相反地，Lewis 等［21］在2011年和2012年美国国家健康和营养调查的12～80 岁女性中，发现PFOA、PFOS 与血清睾酮（testosterone，T）水平无相关性。Kritensen等［11］在丹麦出生队列研究中发现宫内PFOA和PFOS暴露对后代成年女性体内的多种生殖激素均无影响。与成年人相比，青少年可能更容易受到PFAS的干扰：中国台湾青少年女性（12～17岁）血清PFOA、PFOS 和全氟十一酸与血清性激素结合球蛋白、FSH、T 呈负相关［22］。类似地，6～9 岁女孩PFOS暴露与更低的血清T 浓度相关［10］。丹麦欧登塞儿童队列中发现孕早期母体血清PFDA 浓度升高与4月龄女婴血清脱氢表雌酮降低有关［23］。

由此可以看出，尽管人群资料中显示PFAS 与女性生殖功能的关联并不一致，但在PFAS 与E2降低的相关性上结果较为一致，这可能也是PFAS 推迟月经初潮和提前更年期的原因之一。但PFAS 与人群不同性激素水平的关联可能因人群遗传背景、PFAS 暴露水平、生理状态等因素而呈现出不同的趋势。

2.2 PFAS雌性生殖毒性的动物研究

在实验模型中也证实了PFAS 对雌性生殖功能的不利影响，主要涉及PFOS、PFOA、PFBS、PFNA 以及PFDoA。

PFOS 是环境中含量最为丰富的PFAS，也是目前被研究得最多的PFAS 之一。Feng 等［24］给予成年雌鼠PFOS 暴露（0.1 mg·kg-1·d-1）4 个月，发现排卵前卵泡减少，闭锁卵泡增加，间情期延长，这可能是由于类固醇急性调节蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR）组蛋白乙酰化减少，下调Star基因表达，使得E2合成减少；同时发现下丘脑Kisspeptin神经元数量减少，前室旁核中Kiss1mRNA水平降低。Wang等［25］研究也证明了成年雌鼠暴露于10 mg·kg-1·d-1PFOS两周会延长间情期和减少排卵，这是由于PFOS 抑制了雌激素受体α（estrogen receptor α，ERα）诱导的Kisspeptin 神经元活化。新生大鼠（出生后1～5 或26～30 d）暴露于PFOS 或PFOA，下丘脑中Kisspeptin 信号被破坏，Kiss1、Kiss1r和ERαmRNA 表达下调，新生大鼠卵泡减少，阴道开放和初次发情时间均提前［26］。此外，PFOS 体外染毒还会抑制体外培养的猪卵母细胞的活力（半数致死浓度=32 μmol·L-1）和成熟（半数致死浓度=22 μmol·L-1），进一步研究发现，22 μmol·L-1PFOS 破坏卵母细胞和颗粒细胞间的缝隙连接，但连接蛋白43（connexin 43，Cx43）、Cx45和Cx60的基因表达并没有改变［27］。

PFOA 与PFOS 对雌性生殖功能的影响在某些方面有一定的相似性。例如，1.2 μmol·L-1的PFOA 或PFOS均会抑制黄体生成素（luteinizing hormone，LH）刺激的猪卵巢膜细胞中雄烯二酮和P4分泌，以及FSH 刺激的颗粒细胞中E2、P4分泌［28］。除此之外，PFOA 还会诱导氧化应激反应：Chen 等［29］在母鼠孕1～7 d 或孕1～13 d 给予10 mg·kg-1PFOA，发现PFOA 抑制孕鼠卵巢抗氧化酶活性，增加活性氧产生，以及P53 和Bax 蛋白表达，从而抑制黄体的功能。胎鼠卵母细胞暴露于28.2、112.8 μmol·L-1PFOA 会破坏卵丘细胞-卵母细胞复合物中细胞间隙连接，产生活性氧并引起卵母细胞凋亡和坏死［30］。

PFBS作为长链PFAS的替代物，近年来得到广泛的使用，虽然PFBS在体内的半衰期短，但其毒性仍然值得关注。小鼠全孕期给予PFBS（200或500 mg·kg-1·d-1），雌性后代青春期阴道开放和初发情期延迟，间情期延长，成年时卵巢缩小和重量减轻，卵泡数量减少，E2、P4浓度降低。研究者认为这是由低甲状腺素血症介导的［31］。Cao 等［32］研究发现成年雌性小鼠暴露于PFBS（200 mg·kg-1·d-1）两周会诱导甲状腺激素缺乏，下调颗粒细胞和卵丘细胞中AKT-mTOR 信号，从而抑制细胞增殖，促进细胞自噬，破坏卵泡发育和卵巢激素的生物合成。

与PFOS、PFOA 和PFBS 相比，PFDoA 和PFNA 的生殖毒性报道较少。断乳的青春期前雌性大鼠暴露于PFDoA（3 mg·kg-1·d-1，28 d）后下调了卵巢绒毛膜促性腺激素受体（lutropin/chorionic gonadotropin receptor，LHCGR）、Star和胆固醇侧链裂解酶的mRNA 表达，导致E2的产生减少，卵巢中的ERα和ERβmRNA 水平也降低［33］。Hallberg 等［34］用10 mg·L-1PFNA 体外处理牛卵母细胞22 h，随后进行体外受精并观察胚胎发育情况，发现胚胎发育受到负面影响，表现为脂质分布异常，这可能与PPAR 异常激活导致的脂质代谢紊乱有关。

就目前已有的研究而言，PFOS 和PFOA 可以通过干扰下丘脑-垂体-性腺轴和阻碍卵丘-卵母细胞间的通讯诱发生殖毒性，PFOA 还可以诱导氧化应激反应。PFBS 诱发的生殖毒性主要是通过低甲状腺素血症介导，而关于PFDoA 和PFNA 的研究较少，可能与性激素合成以及脂质代谢异常有关。

3 PFAS的雄性生殖毒性

3.1 PFAS对男性生殖影响的流行病学研究

PFAS 与男性生殖影响的人群研究不多，并且结果并不一致。广州的一项横断面研究发现男性精液中多种PFAS 浓度与精子活力呈负相关［35］。Louis 等［36］在美国收集了501 对计划怀孕的夫妻中男性血液和精液样本，检测发现包括PFOS 和PFOA 在内的6 种PFAS浓度与精液质量下降有关，如精子头部面积和周长降低、双头精子和未成熟精子比例升高等。丹麦奥胡斯队列中169 名男性后代（19～21 岁），其母亲孕30 周血中PFOA 水平与后代较低的精子浓度和总精子计数相关［37］。多项研究表明，男性体内PFAS水平与T浓度降低［38-40］、LH和FSH浓度升高有关［37，41-42］。但也有研究结果显示PFAS对精液质量无明显的影响［39，42-43］，Vested等［37］研究结果也仅显示精子质量与PFOS 相关，而不是PFOA。此外，还有学者认为，PFAS 会影响精子DNA的甲基化水平［44］，干扰精子减数分裂和DNA 完整性等［45］。这些结果的差异可能是研究人群的遗传背景、暴露水平不同，样本的代表性，研究方法不同等因素造成的。

3.2 PFAS对雄性生殖毒性的动物研究

PFAS 对动物的生殖毒性研究主要集中于PFOS、PFOA、PFDoA和PFNA这4种物质。

研究表明，大鼠宫内暴露PFOS 会降低胎鼠睾丸组织T 水平，降低胎鼠Leydig 细胞数量，损伤胎鼠的生殖系统［46］。PFOS 还会影响成年雄性大鼠下丘脑-垂体-睾丸轴，如下丘脑去甲肾上腺素浓度增加，GnRH浓度降低，LH 和T 受到抑制，FSH 受到刺激，此外还观察到促性腺激素细胞变性、睾丸水肿等形态学改变［47］。Wan 等［48］发现PFOS（40 或80 μmol·L-1）会干扰Sertoli 细胞紧密连接的渗透性屏障，导致细胞质溶胶中的肌动蛋白微丝破裂，从而干扰细胞连接蛋白（ZO-1、N-cadherin）的定位，10 μmol·L-1的白藜芦醇（抗氧化剂）预处理可以防止PFOS 引起的毒性。Li等［49］认为这可能是由于PFOS 下调Cx43 蛋白所导致的，Cx43 过表达可以阻止PFOS 的作用。Qiu 等［50］发现PFOS 会剂量依赖性地增加小鼠血睾屏障的通透性，增加p38/ATF2磷酸化和基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）的表达，降低血睾屏障接头蛋白Occludin和Cx43的表达；体外Sertoli细胞模型也与体内结果相似，抑制p38、MMP9 和敲低ATF2均会减弱PFOS 对Sertoli 细胞的影响。小鼠青春期PFOS暴露下调Leydig 细胞中Lhcgr、Cyp11a1和Cyp17a1的mRNA 和蛋白质水平，PFOS 在体外浓度≥50 nmol·L-1时抑制未成熟的Leydig 细胞中T 分泌，≥500 nmol·L-1时会下调Lhcgr，抑制Bcl-2，增加Bax水平，从而导致Leydig 细胞凋亡［51］。此外，PFOS 体外处理小鼠Leydig细胞会诱导活性氧产生并降低线粒体膜电位，通过抑制Bcl-2和上调Bax诱导细胞凋亡［52］。

成年雄性小鼠给予PFOA（1.25、5或20 mg·kg-1·d-1）处理28 d，PFOA 以剂量依赖的方式积累在附睾中，并导致附睾重量减少，多不饱和脂肪酸组成改变，附睾中的蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated kinase，AMPK）信号激活，说明附睾是PFOA 的潜在靶标［53］。Lu 等［54］的研究发现，5 mg·kg-1·d-1的PFOA 处理28 d 会改变小鼠睾丸内吞相关蛋白的表达模式，改变小鼠睾丸miRNA谱。PFOA 下调Leydig 干细胞特异性基因（Lhcgr、清道夫受体B1 基因、Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Hsd11b1和Cyp17a1）的表达水平及其蛋白水平，降低血清T水平，减少增殖细胞核抗原阳性Leydig干细胞数量［55］，说明PFOA 会抑制SLC 细胞增殖。此外，小鼠体内PFOA 暴露或体外PFOA 处理mLTC 细胞系均会刺激Leydig 细胞特异性表达的糖皮质激素结合球蛋白（corticosteroidbinding globulin，CBG），而CBG 参与诱导类固醇生成蛋白，包括StAR、CYP11A1、CYP17A1、3β-羟类固醇脱氢酶，从而促进P4的增加［56］。但Zhao 等［57］认为PFAS对小鼠Leydig 肿瘤细胞孕激素产生的抑制作用可能部分归因于活性氧水平的增加和线粒体膜电位的降低，还发现PFAS 的碳链越长，抑制率越高，半数抑制浓度排序为PFBA（C4）＞全氟己酸（C6）＞全氟庚酸（C7）＞PFOA（C8）＞PFNA（C9）=全氟癸酸（C10）＞全氟十一酸（C11）＞PFDoA（C12）=全氟十四酸（C14）［57］。

未成年大鼠（出生后21～35 d）暴露于0、5、10 mg·kg-1·d-1的PFDoA，PFDoA 降低血清中T、LH、FSH浓度，下调类固醇合成相关基因表达，但不影响Leydig细胞数量和增殖，进一步研究发现，PFDoA 降低NAD-依赖性去乙酰化酶Sirtuin-1 和过氧化物酶体增殖物激活受体γ 辅激活因子1α 蛋白水平，降低AMPK和AKT2磷酸化［58］。10 μmol·L-1PFDoA体外处理Leydig祖细胞会降低细胞活力，刺激细胞内活性氧生成并诱导Leydig细胞凋亡［58］。Shi等［59］给予成年大鼠PFDoA 灌胃（1、5、10 mg·kg-1·d-1）14 d，PFDoA 降低睾丸绝对重量和血清T 水平，中、高剂量组Scarb1、Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Cyp17a1和Hsd17b3的表达下调，高剂量组血清LH 水平降低，总胆固醇水平升高，不影响FSH水平；此外，中、高剂量组Leydig细胞、Sertoli细胞、生精细胞表现出凋亡特征。成年雄性大鼠长期（110 d）暴露于PFDoA（0.02、0.2、0.5 mg·kg-1·d-1）会降低睾丸StAR、CYP11A1蛋白水平，但不影响类固醇5α-还原酶1、3-α 羟基类固醇脱氢酶和CYP19A1［60］。0.2、0.5 mg·kg-1PFDoA 还会通过增加脂质过氧化和降低超氧化物歧化酶活性来诱导睾丸组织发生氧化应激，并通过抑制H-ATP酶和细胞色素C 氧化酶来破坏线粒体呼吸［61］；进一步研究发现细胞分裂周期基因2 的磷酸化活性降低可能与PFDoA 诱导的睾丸毒性有关［62］。使用小鼠原代Leydig 细胞和mLTC-1 细胞，发现PFDoA 通过增加活性氧水平抑制Star启动子活性及其mRNA 和蛋白表达［63］。

给予怀孕Parkers 小鼠（孕12 d 至分娩）PFNA（0、2、5 mg·kg-1·d-1）并留取雄性后代至出生后第3天，发现PFNA通过下调睾丸Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Hsd17b3、Wt1和Nr5a1表达抑制T合成，并降低出生后3 d雄性后代的胰岛素样因子3 的表达［64］。Singh 等［65-67］在随后的进一步研究中发现，短期（出生后25～38 d）和长期（出生后25～114 d）的PFNA 暴露，均会诱导Parkers小鼠睾丸发生氧化应激反应，抑制抗氧化反应以及类固醇激素合成，从而抑制生殖细胞增殖，促进细胞凋亡。Feng 等［68］研究证明，5 mg·kg-1·d-1PFNA 处理大鼠两周会降低血清T 水平，升高E2水平，生精细胞有显著的凋亡特征，且认为这种凋亡可能与Fas 死亡受体依赖性凋亡途径有关。

由此可见，PFAS 可以通过不同机制在雄性动物体内诱发生殖毒性。主要机制涉及诱导细胞氧化应激反应，影响脑-垂体-性腺轴，影响支持细胞紧密连接蛋白，以及多途径影响类固醇合成酶等，导致雄性生殖系统细胞凋亡，血睾屏障通透性增加，睾酮水平降低等。然而，动物研究主要集中在PFOS、PFOA、PFNA、PFDoA 4种物质上，没有考虑化学物之间的联合作用。

4 总结与展望

目前，PFAS 普遍存在各种环境介质中，人群通过多种途径接触PFAS。尽管我国生态环境部在2019年3月发布公告，禁止PFOS 及其盐类和全氟辛基磺酰氟除可接受用途外的生产、流通、使用和进出，该措施仍未严格限制PFOS 的生产使用，且没有关于PFOA 的相关限制举措，所以人群对于PFAS 的认知水平非常有限。在人群流行病研究中，尽管研究结果并不完全一致，但大多数研究发现PFAS 会对女性生殖功能产生不利影响，包括扰乱月经周期，干扰激素正常水平，增加不孕风险；对于男性，研究表明PFAS 与男性精子质量下降、T 水平降低有关。但目前的研究大多限于几类常用的PFAS，对于PFAS 的替代产品的研究较少，也没有考虑PFAS 共暴露的影响，并且大样本队列研究均来自国外，国内的相关研究还较为有限。因此，在以后的研究中应该更加关注本国的污染情况以及人群的暴露水平，扩大研究多种类的PFAS 以及新型替代物与人群生殖功能的关联，同时探索PFAS 共暴露对生殖健康的影响。

在动物研究中，机制的探讨主要涉及诱导细胞氧化损伤，影响下丘脑-垂体-性腺轴，通过多种途径影响类固醇激素的合成等，但由于动物实验往往是单物质暴露（多是PFOS 和PFOA），以及PFAS 在体内发挥毒性作用的阈值没有明确的界定，所以不同研究的剂量有所区别。因此，在往后的研究中应扩大剂量范围，深入研究效应机制，探讨是否具有联合毒性作用、多代效应以及可行的干预保护措施。