口蹄疫病毒病毒样颗粒疫苗的研究进展

李国秀，丁耀忠 综述，刘磊，张杰 审校

1.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃兰州730046；2.甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州730070

口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease，FMDV）引起的一种烈性传染病，主要感染牛、猪、绵羊、山羊等偶蹄动物。FMDV 有7 种不同的血清型（O、A、C、Asia 1、SAT 1、SAT 2 和SAT 3），各血清型间无交叉反应。FMD 虽死亡率较低，但给全球畜牧业造成了严重的经济损失，我国将其列为一类传染病。

病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs）由病毒的衣壳蛋白组成，其缺乏病毒核酸而不具有传染性，VLPs 形态结构与天然病毒粒子类似，保留了天然病毒粒子的空间构象。VLPs 疫苗能够有效地诱导T 细胞和B 细胞的免疫反应。目前，我国预防FMD 仍采用灭活疫苗，但灭活疫苗存在一定的局限性。因此，开发一种廉价的、非传染性的亚单位或VLPs 疫苗尤为重要的。近年来，VLPs 还在纳米生物技术中作为外源抗原载体或支架材料而得到广泛应用。国内外许多学者也开展了对FMDV VLPs 的研究，并取得一定的进步。本文就FMDV 及其VLPs 疫苗的研究进展作一综述，为今后FMD 的防控提供参考。

1 FMDV 结构蛋白

FMDV 粒子包含一个单链RNA 基因组，大小为8 400 bp，病毒粒子呈二十面体对称，翻译后加工成12 种蛋白质（Lpro，VP1，VP2，VP3，VP4，2A，2B，2C，3A，3B，3Cpro，3D）［1］。FMDV 结构蛋白由VP1、VP2、VP3 和VP4 共4 种衣壳蛋白各60 个拷贝组成，是P1衣壳前体多肽的裂解产物。在组装过程中，5 个含有VP0、VP1 和VP3 拷贝的原基组装成1 个五聚体，12个五聚体与1 个新转录的RNA 分子结合形成1 个病毒颗粒［2］。在RNA 存在下，VP0 最终成熟切割产生VP4 和VP2。VP1、VP2 和VP3 暴露于表面，VP1围绕5 倍对称轴，含有1 个G-H 环，其顶部有高度保守的RGD 氨基酸基序［3］，RGD 序列吸附至细胞表面并与表面受体结合，是病毒感染的关键。VP2 和VP3围绕二十面体3 倍轴交替。VP4 在FMDV 血清型间高度保守，且VP4 和RNA 紧密结合，形成病毒粒子的内部结构。VP0、VP1、VP3、Lpro、2B、3A、3Cpro蛋白在抑制宿主先天免疫应答中发挥作用［4］。

2 FMDV 疫苗

2.1 传统疫苗及其缺陷 FMD 是全球最主要的动物疾病之一。在发展中国家，FMD 的控制和根除依赖于疫苗接种。20 世纪80 年代我国培育出温度敏感毒株和O 型OP4 细胞培养弱毒疫苗［5］，由于技术的限制，导致毒株在模式动物体内驯化困难。同时RNA 病毒在宿主体内极易由于基因突变导致毒株返强或毒株重组等情况。随后，弱毒疫苗逐渐被灭活疫苗所取代，灭活疫苗在FMD 防控中占主导地位。我国灭活疫苗的发展经历了两个技术阶段，即转瓶培养细胞生产病毒抗原及细胞悬浮培养工艺生产病毒抗原［6］。欧洲和南美洲一些国家经历了10 多年灭活疫苗接种后，疫情得到了控制［7］。尽管灭活疫苗在当前的FMD 控制方面取得了成功，但近年来其在紧急控制规划应用中也存在一些问题和局限性，如疫苗生产过程中出现病毒逃逸及病毒灭活不完全等问题，导致接种动物感染FMDV［8］。因此，为避免传统灭活疫苗所带来的不足，迫切需要开发一种新型廉价的FMDV 疫苗，如重组亚单位疫苗、合成肽疫苗、VLPs 疫苗［9-11］。

2.2 FM D V V LPs疫苗 VLPs 通常是由病毒衣壳的一种或多种结构蛋白组装成的球形空腔结构［12］，VLPs 安全性高、细胞摄取效率高，具有良好的溶解度与生物相容性及靶向给药和载药能力［13］，还可通过与天然病毒感染相似的途径呈递给树突状细胞，继而有效地诱导动物机体产生体液与细胞免疫，因此，VLPs 被认为是一种理想的生物载体。相关研究显示，VLPs 自身具有佐剂分子的功能效应，不需要与佐剂混合乳化就可诱导机体产生有效的免疫刺激［14-15］。随着研究的深入与技术的不断进步，基于VLPs 的应用具有广阔发展前景。目前，已构建出多种病毒的VLPs，其中FMDV VLPs、乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）VLPs、猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）VLPs、牛细小病毒（bovine parvovirus，BPV）VLPs 和猪圆环病毒2型（porcine circovirus type2，PCV2）VLPs 已成功作为载体将FMDV 抗原表位嵌合在表面，并获得了针对FMDV 的保护力。VLPs 既可与其他危害严重的传染病一起制备成为多价苗，也可与同血清型病毒一起制备联苗［16］。

3 FMDV VLPs 高效表达系统

3.1 原核表达系统 VLPs 疫苗的开发尝试了多种表达平台，其中原核表达系统最常用的是大肠埃希菌表达系统，其表达量大、产物易于纯化、成本低廉、培养技术简单、遗传背景清晰，因此广泛应用于多个领域［17］。重组FMDV VLPs 是由VP0、VP1 和VP3结构蛋白组装而成，可通过3 个单独结构衣壳蛋白的共同表达或病毒衣壳前体P1-2A 与病毒蛋白酶3C 的共同表达来实现［18］。XIAO 等［19］开发了大肠埃希菌共表达系统，该系统通过单个质粒串联驱动FMDV 衣壳蛋白（VP0、VP1 和VP3）的表达，经大规模发酵获得共表达的FMDV 衣壳蛋白，并在体外自组装VLPs。研究结果表明，大肠埃希菌体外组装VLPs可作为一种有效的FMD 疫苗候选方式。GUO 等［17］利用分子伴侣蛋白SUMO 对大肠埃希菌中FMDV的衣壳蛋白VP0、VP1 和VP3 进行了高效表达，将融合蛋白中的相扑片段用SUMO 切割酶去除后，将3 种衣壳蛋白组装成VLPs，大小和形状与FMDV 颗粒相似，该VLPs 在豚鼠、猪和牛体内均可产生较强的中和抗体。DONG 等［20］发现，用于疫苗VLPs 上显示的表位肽EP141-160 具有较高的免疫活性，随后，研究人员将反义RNA 与VLPs 结合，利用原核共表达系统制备FMDV 疫苗。结果表明，表位RNA VLPs可诱导小鼠对FMDV 产生免疫应答。LEI 等［21］将3种FMDV 多表位抗原的分子内佐剂与A 型和O 型FMDV 代表性毒株VP1 上的B 细胞表位或非结构蛋白3A 上的T 细胞表位的编码基因进行串联，并插入至截短型乙肝核心抗原的主要免疫原区进行合成，在原核表达系统中获得不同的重组抗原，并在体外高效自组装成带有FMDV 抗原表位的VLPs。PUCKETTE 等［22］将P1-2A 多聚蛋白和突变体3C（L127P）蛋白克隆至载体中，制备VLPs，突变体3C 蛋白酶L127P，显著提高了重组FMDV 亚单位抗原的产量，L127P 突变代表FMD 疫苗生产的新进展。

3.2 昆虫杆状病毒表达系统 昆虫杆状病毒表达系统常用于表达FMDV VLPs，利用含杆状病毒基因组作为重组表达载体转染Sf9 昆虫细胞。真核表达系统有翻译后加工修饰过程、表达量大，且具有良好的免疫原性［23］。LIU 等［24］利用昆虫细胞表达系统构建了一种新型嵌合型VLPs，将O 型FMDV 的VP1基因嵌合至A 型P12A 基因中，形成嵌合基因，并利用A 型FMDV 蛋白酶3C 成功将其裂解，自组装成VLPs。CHANG 等［25］通过筛选噬菌体展示文库和融合表位肽的分析，鉴定出O 型和Asia1 型的表位8E8和3E11，利用杆状病毒载体系统表达野生型BPV VP2 和8E8 表位嵌合VP2 蛋白，在Sf9 细胞中产生BPV VP2 蛋白，通过电镜观察到融合蛋白能够组装成VLPs，嵌合型VLPs 接种小鼠后均可产生抗BPV IgG 抗体与抗FMDV 中和抗体，其中抗FMDV 的中和抗体滴度最高为1 ∶176。因此，鉴定高度保守的中和表位有助于开发嵌合型FMDV 疫苗。另外，在昆虫杆状病毒表达系统中，pH 对VLPs 的组装有一定影响，研究发现，O 型FMDV 衣壳比其他血清型对酸性敏感，在低pH 的昆虫细胞中较难产生空的O 型VLPs［26］。

4 VLPs 疫苗的免疫效果

许多研究表明，FMDV VLPs 疫苗对动物能够产生较好的免疫效果，LIU 等［24］对组装的嵌合型VLPs进行了免疫原性和保护效果的评价，结果表明，嵌合型VLPs 能引起明显的体液和细胞免疫，接种嵌合VLPs 的5 只豚鼠中，有4 只完全获得了FMDV 毒株O ／ MAY98 的50%豚鼠感染剂量（50% guinea pig infectious doses，GPID50）的保护，这些数据表明，嵌合型VLPs 是开发FMDV 新型疫苗的潜在候选者。GUO 等［17］利用原核表达系统制备了VLPs，并作为免疫原用于豚鼠、猪和牛，研究结果显示，FMDV 特异性中和抗体、T 淋巴细胞和IFNγ 被有效地诱导免疫动物，FMDV VLPs 对牛的50%保护剂量（50%protection dose，PD50）可达6.34。上述研究结果表明，FMDV VLPs 疫苗具有良好的研发潜力。

5 小 结

FMD 给全球带来巨大的经济损失，因FMDV 毒株易变异，使FMD 难以得到有效控制。随着技术的进步，新型疫苗的出现不仅克服了传统疫苗的缺点，且在FMD 的防控上也取得了进步。目前，虽然已有多种病毒的VLPs 在实验室中成功制备，但只有极少数在疫苗应用中取得突破，获得合适的组装工艺、放大制备工艺和制剂工艺组合是阻碍其向前发展的重要原因。且由于VLPs 的特殊性，几种表达系统组装VLPs 的效率比较低、较难组装，利用其制备和组装结构复杂的VLPs 仍存在诸多问题。另外，选择最佳的新型疫苗不仅需要评估其免疫原性，还需要评估其生产策略的可行性。因此，VLPs 作为FMDV抗原表位载体的疫苗还需要进行更深入地探索和研究。