吴茱萸碱抗消化系统肿瘤作用机制的研究进展

范春娇，黄 鹏，黄贵华，邱 华，张晓梅

（1.广西中医药大学研究生院，广西 南宁530001；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁530023）

吴茱萸辛、苦、热，主入肝胃脾经，为消化系统常用中药，具有散肝寒、降胃逆、补脾虚的功效，临床上常用于肝寒头痛、胃逆呕吐、脏寒吐泻、五更泻等。吴茱萸碱（evodiamine，EVO）是吴茱萸主要生物碱之一，其有多种生物学效应，如缓解慢性疼痛［1］、分泌儿茶酚胺［2］、抗炎、抗肥胖［3］、抗动脉粥样硬化［4］、保护心血管［5］等作用。有研究报道其通过抑制炎症反应和维持线粒体抗氧化功能来减轻化疗药引起的神经病理性疼痛［6］；通过激活内源性凋亡通路选择性抑制多发性骨髓瘤细胞生长［7］；通过抑制脂肪细胞中mTOR-S6K信号和IRS1丝氨酸磷酸化实现降低体重，控制血糖的作用［8］；通过Rho/NF-κB途径改善抗氧化和抗炎状态保护胃黏膜，治疗胃溃疡［9］；通过调节nNOS和抑制AMPA受体GluA 1缓解偏头痛［10］；通过抑制转化生长因子-1/Smad途径，调节内皮细胞到间质的转化，从而预防心肌纤维化［11］等。此外，EVO还可以通过多种独特的分子机制，抑制肿瘤血管的生成［12］、诱导癌细胞凋亡和抑制癌细胞生长、侵袭和转移，从而达到抗肿瘤的作用，其抗癌活性可能与Wnt/β-catenin、mTOR、NF-κB［13］、转化生长因子β1（TGF-β1）［14］和/或p53/p21/Rb等信号通路［15］有关。因此，EVO通过何种途径发挥其抗肿瘤作用是近年的研究热点。本文对吴茱萸碱抗消化系统肿瘤作用机制的研究进展作一综述，为EVO在日后临床应用和深入研究提供依据。

1 肿瘤的发生发展

对于肿瘤的发生发展，医学界有了较统一且深入的认识，在细胞层面来看，可以总结为阻止细胞增殖及促进细胞分化的信号异常、细胞获得异常增殖能力；细胞凋亡过程异常、细胞具有侵袭浸润的能力及诱导异常血管生成等。而在这些事件中，主要涉及肿瘤干细胞（CSCs）异常分化增殖、信号通路及癌基因的异常激活，因此阻止这些事件的发生进展成为了治疗癌症的关键。

2 EVO对信号通路的影响

EVO通过干预Wnt/β-catenin、mTOR、PI3K/Akt、Notch等信号通路传导，诱导肿瘤细胞周期进展停缓，增加肿瘤细胞凋亡及坏死比率、抑制肿瘤微血管的生成、阻止肿瘤细胞周围侵袭及远处转移，进而达到控制肿瘤的目的。研究表明，尽管EVO对肿瘤细胞具有杀伤作用，但其作用是选择性的，有研究报道，EVO对人正常细胞无细胞毒作用［16］。

2.1 Wnt/β-catenin信号通路及Notch信号通路

Wnt/β-catenin信号通路是维持细胞信号稳态和胚胎发育所必需的，其在胚胎发育过程和维持干细胞自我更新和分化扮演重要角色，该通路的异常活性被证明可以促进CSCs的自我更新，刺激血管生成以及维持高度耐药，与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、上皮细胞转化、肿瘤微环境、干性和化疗耐药有关，其抑制凋亡的功能可能促进肿瘤的化疗耐药［17-19］。

Notch信号是干细胞不对称分裂的调节因子，其与配体之间的相互作用启动了调节分化、增殖和凋亡的信号级联反应。在胰腺癌［20］、胃癌［21］、和结肠癌［22］等多种实体瘤中的研究发现，Notch作为癌基因呈现出高表达状态，其信号通路的异常激活可诱导细胞增殖、转移和上皮-间充质转化。抑制一个子细胞中的Notch信号对于这些肿瘤的不对称分裂为非干细胞状态是至关重要的［23］。

EVO对Wnt/β-catenin及信号通路的作用：在Cai等［24］的实验中发现，Wnt/β-catenin与胃癌细胞球的形成能力相关，同时，经EVO干预后的胃癌干细胞中Wnt/β-catenin信号相关基因，如β-catenin和c-myc、cyclinD1等基因表达水平呈现下调趋势，由此说明EVO能够影响、调节胃癌干细胞的自我更新过程。Wen等［25］研究发现，EVO能够降低胃癌干细胞（GCSCs）的球体形成能力及抑制胃癌细胞（GCC）的迁移特性，并且证实了EVO通过下调Wnt通路，显著抑制GCSCs的增殖和自我更新，减少EMT因子的表达，进而导致GCC的茎性下降。王强等［26］用EVO干预胰腺癌BxPC-3和PANC-1细胞株时，发现EVO能够通过抑制细胞株的Wnt通路下游靶分子c-Myc和Cyclin D1的表达，刺激胰腺癌细胞的凋亡和自噬过程增加，使细胞增殖过程受到阻滞。Wnt配体的表达情况直接影响Wnt/βcatenin信号的转导过程，在大肠癌中，王元惠等［27］实验发现，经EVO干预的大肠癌细胞株HT 29中促进血管生成的血管内皮生长因子（VEGF）及介导肿瘤向周围组织浸润的基质金属蛋白酶（MMP）表达下降，同时，Wnt和β-catenin的mRNA含量下降，由此得出这样的结论，EVO可能通过调节Wnt/βcatenin信号阻止了大肠癌恶性行为。在研究结肠癌过程中发现，Notch信号中Notch1、HES5、HES1、Jagge及Wnt信号中LRP5和LEF1基因的表达均受抑制，说明了EVO能够同时调节Notch及Wnt信号通路，从而达到抑制CSCs生物活性［28］。

2.2 mTOR信号通路

mTOR信号通路参与了蛋白的合成、能够调节肿瘤细胞的生长、增殖、分化、存活和迁移丝氨酸蛋白激酶，影响着肿瘤细胞的发生发展。该通路的失控在细胞生长、增殖、代谢和血管生成等多种细胞功能的调控中起着至关重要的作用。有研究发现［29］，mTOR在胃癌中高度活化，其下游有2个非常重要的分子，真核细胞起始因子el F-4E结合蛋1（4E-BP1）和核糖体蛋白S6激酶（p70S6K），分别参与蛋白翻译、合成、细胞生长和周期调节。

EVO作用于mTOR信号通路：在胃癌中，mTOR通路通过在肿瘤中增加mTOR复合物1（MTORC1）的磷酸化，降低P70S6K1-mTORC2的反馈活性导致线粒体过程、血管生成和核糖体生物生成不受控制和增加，进而影响肿瘤蛋白质合成过程、抑制癌细胞生长、增殖和自噬［30］。刘鑫等［31］研究发现，EVO作用于胃癌SGC-7901细胞后抑制mTOR、p70S6K和4EBP1mRNA的表达，在蛋白水平上抑制细胞mTOR总蛋白及其磷酸化蛋白的表达，由此推测EVO可能通过抑制上游Akt，AMPK激酶活性影响mTOR及其磷酸化蛋白表达或是作用于mTOR及其磷酸化蛋白进而抑制下游底物的表达。

2.3 骨形态发生蛋白（BMP）通路

BMP属于转化生长因子一员，最先发现具有控制骨形成的作用。在胃肠道中，BMP能通过调节间质微环境，保护结肠间充质的息肉起始和肠道分泌前体细胞的终末分化［32，33］，在胃肠道发育和病理过程中起关键作用。大多数BMP主要由间充质产生，并通过旁分泌或自分泌途径激活其信号通路。在结肠癌、肝癌中，BMP通路能够抑制肿瘤的生长、血管生成及上皮间充质转化，其表达水平与肿瘤分期呈正相关。

EVO对P53、BMP9的作用：肿瘤抑制蛋白（p53）是一种能够调控多种肿瘤细胞周期、凋亡、DNA损伤修复、代谢、炎症和免疫反应、血管生成和转移的肿瘤抑制因子，在维持染色体及基因组稳定方面起着关键作用［34］。研究发现EVO可显著上调HCT 116细胞骨形态发生蛋白9（BMP9）及缺氧诱导因子-1α的表达，在HCT 116细胞中，EVO可增加p53的磷酸化，BMP9可使其磷酸化增强，而BMP9沉默可使其磷酸化水平降低。此外，EVO对p53的作用可被缺氧诱导因子-1α增强，而被缺氧诱导因子-1α沉默而减弱，其机制可能是通过上调缺氧诱导因子-1α的表达，部分提高P53的活性，从而介导BMP9的抗癌作用［35］。

2.4 JAK2/STAT 3信号通路

信号转导与转录激活因子3（STAT 3）是STAT家族中最常被被激活的成员，其能够将信息传递到细胞核，介导着细胞内的信号传递。在生理状态下，JAK激酶能够激活STAT参与细胞的增殖与分化、存活与凋亡及细胞免疫等过程［36］。在病理状态下，异常的STAT 3信号通过激活MMP2、MMP9和Cten的表达促进癌细胞增殖以及迁移和侵袭，通过促进EGF、VEGF、PVDF和HGF等生长因子的表达来促进肿瘤血管生成，进而促进肿瘤的进展［37］。大量研究表明，JAK/STAT 3信号通路在血液恶性肿瘤及实体肿瘤（如肺癌、胃癌、肝细胞癌等）中可通过VEGF促进肿瘤血管形成，因此抑制JAK/STAT 3通路的激活能够成为抑制肿瘤的发生发展的一个靶点。

EVO对JAK2/STAT 3信号通路的作用：在结肠癌中，研究证明用EVO干预HCT-116细胞后出现细胞核浓缩聚集、染色质碎裂成块等形态学改变。同时，HCT-116细胞内p-STAT 3的表达受到抑制，EVO可能是通过抑制JAK2/STAT 3信号通路的激活从而抑制人结肠癌HCT-116细胞活性［38］。

2.5 SIRT 1信号通路

沉默信息调节因子1（SIRT 1）是一种在调节基因表达、细胞生长生存、衰老、凋亡及分化等过程中具有重要作用的组蛋白脱乙酰酶。SIRT 1在肿瘤组织中呈现高表达状态，其能够促进肿瘤的增殖和迁移。近期研究发现，SIRT 1可能参与调节肿瘤的形成和发生发展过程，并在许多恶性肿瘤中检测到其表达异常［39］。SIRT 1可能是判断大肠癌预后不良的一种新的生物标志物［40］。

EVO对SIRT 1、NF-κB的作用：NF-κB是一种在肿瘤发生中起主要作用的转录因子，对细胞的癌变、转移及生存具有调控作用。同时NF-κB还能调控多种基因，如细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）和c-Myc、抗凋亡基因（如Survivin、Bcl-2和Bcl-XL）。研究表明，EVO能够抑制NF-κB的诱导性和结构性激活及NF-κB参与调节的基因表达，而这些强有效的抑制作用为EVO在抑制增殖、诱导细胞凋亡以转移浸润等过程提供了分子基础［41］。相反的，李海星等［42］认为EVO能激活NF-κB信号通路，在观察EVO干预大肠癌HCT-116细胞中发现，经EVO作用后的HCT-116细胞，其NF-κB m RNA和蛋白的表达增加，而SIRT 1、MMP-9 mRNA和蛋白的表达出现抑制，从而说明了EVO通过抑制SIRT 1的表达，激活NF-κB信号通路，进而下调MMP-9表达来实现对大肠癌的抑制。

2.6 Hippo-YAP信号通路

Hippo信号调控具有细胞增殖、存活、分化的作用，参与组织稳态和肿瘤抑制等多种过程，其能够通过抑制YAP和TAZ参与器官大小控制和肿瘤发生的抑癌途径［43］。在Hippo-YAP通路中YAP的过度激活也导致肿瘤的发生。

EVO对Hippo-YAP信号通路的作用：赵爽等［44］用EVO干预肝癌BEL-7402细胞，发现EVO能够增加BEL-7402细胞凋亡比率，且BEL-7402的细胞周期停滞于G2/M期，同时MST 2和LATS1在BEL-7402细胞中的表达上调，而YAP表达受到抑制，提示EVO可能通过激活Hippo信号通路抑制下游基因YAP的表达从而促进肝癌BEL-7402细胞的凋亡。

2.7 NOD1通路

NOD1参与维持组织内稳态和宿主对细菌和某些病毒的防御，其不仅能通过介导p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径启动NF-κB依赖和MAPKB依赖的基因转录［45］，以调节宿主防御和组织稳态、增强癌细胞的黏附、迁移和转移，还能激活多个下游的炎症信号通路及免疫信号通路促进细胞因子和趋化因子的产生，而对这些细胞因子和趋化因子对病原体的清除是非常重要的［46，47］。

EVO对NOD1信号通路的作用：在肝癌细胞中NOD1的敲除显著诱导细胞周期进入有丝分裂期，而过表达的NOD1显著诱导细胞周期阻滞在G1期［48］。Guo等［49］发现EVO能够通过上调Rp53和Bcl-2相关X蛋白（Bax）蛋白，下调B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、cyclinB1和cdc2蛋白表达诱导肝癌Hep G2和SMMC-7721细胞周期停滞于G2/M期。此外，EVO还降低了肝癌细胞中NOD1、p-p65、p-erk、pp38和p-jnk的表达水平，这说明了EVO可能通过抑制NOD1信号通路促进肝癌细胞凋亡。

2.8 EVO促进细胞凋亡、诱导细胞周期阻滞

细胞凋亡是以DNA片段化、核固缩和特异性蛋白质降解为特征的，其发生是一种自主有序的生理过程，凋亡抵抗是肿瘤的一个标志，是抗癌治疗的重要障碍。细胞凋亡在组织内稳态中起重要作用，并受促癌基因、抑癌基因、半胱氨酸天冬氨酸（caspase）蛋白酶、Survivin等调控。在促癌基因及抑癌基因中，Bax表达增多及Bcl-2抑制提示细胞凋亡的正向作用。而caspase蛋白酶作为细胞凋亡过程的中心执行者，在当中扮演着不可或缺的角色。Survivin是一种对凋亡产生抑制作用的蛋白，在细胞周期S期和G2/M期的有丝分裂中常有表达，并且显著促进细胞增殖，在癌细胞中，Survivin的表达是失控的［50］。调节上述基因的表达，对癌细胞的凋亡及增殖过程有积极作用。

Yang等［51］研 究 发 现，胃 癌SGC-7901细 胞 经EVO干预后，癌基因Bcl-2/Bax比率显著下降，并且对Bcl-2磷酸化，同时通过激活caspases提高caspase-3活性产生一氧化氮（NO）增加SGC-7901细胞凋亡比例。Shen等［52］研究发现，经EVO处理的胃癌细胞中，Survivin mRNA水平呈剂量依赖性降低，caspase-3 mRNA水平升高，提示EVO通过抑制抗凋亡基因Survivin表达，增加促凋亡caspase-3 mRNA基因表达从而达到降低胃癌细胞增殖比率，促进细胞凋亡的目的。在结肠癌中，Zhang［53］发现EVO作用Lovo细胞后，cyclinA/Cdk2复合体的形成比率下降，癌细胞阻滞于S期，提示EVO通过诱导caspase依赖的细胞凋亡和S期阻滞来抑制癌细胞的体内外增殖。

3 小结

近些年，EVO抗肿瘤作用成为研究热点，其通过调节相关信号通路，对细胞周期及细胞凋亡进行干预，抑制或增加肿瘤相关基因的表达，进而阻止肿瘤血管生成、细胞迁移和侵袭等，但是信号通路并不是孤立地起作用的，而是相互联系，一条信号通路的改变会引起另一条信号通路的改变。目前EVO抗癌活性的靶向性有两点值得探讨：（1）能够区分正常细胞和癌细胞，但并非对所有癌细胞都有杀伤作用，而是针对特定的癌细胞系有很强的细胞毒作用，其立体结构可能与其抗癌活性有密切关系。（2）EVO可特异性地识别某些癌细胞特有的表面或细胞内受体蛋白，从而与其结合启动死亡途径，靶向性的杀伤癌细胞。而这些特异性的受体或信号在EVO耐受的癌细胞或正常细胞因中不表达或表达较少，EVO无法启动死亡途径从而不能影响该类细胞的生存。虽然近些年实验证明EVO的抗癌作用，其可能作为一种潜在的抗增殖药物单独用于结肠癌治疗或作为一种佐剂，但因其水溶性低且体内代谢速度快，半衰期短，应用受到了限制，这些问题将有待解决。