反向分子对接技术在中药活性分子作用机制研究中的应用*

温梓辰，张万祥，吴 倩，杨玉佩，谢 谦，钟 辉，盛文兵，彭彩云

（湖南中医药大学药学院中医药民族医药物创新发展国际联合实验室/创新药物研究所，湖南 长沙 410208）

在如今新药研发的热潮中，中医药已逐渐成为研究关注的焦点。然而，中药具有多成分、多靶点的特征，导致中药材的药效物质基础及其作用机制无法明确，从而阻碍了中医药的发展。目前，研究中药材活性成分及其作用机制的主要方法有血清药物化学方法、“谱-效”关系分析方法、药效差示血清色谱法、分子生物色谱法等，但都无法清晰解释中药活性与疗效的内涵。小分子活性化合物与靶点的相互作用并不一一对应，而且通过实验方法预测单个化合物的靶标蛋白是一个耗时且昂贵的过程[1]，因此使用计算技术进行虚拟筛选成为前期实验的有力工具[2]。反向对接技术是以小分子化合物为探针，通过空间和能量匹配在靶点数据库中相互识别，按照匹配程度由高到低进行打分和排序，通过排序结果，在数据库中筛选活性化合物潜在的蛋白靶点，以探索其作用机制和副作用等[3-4]。笔者从反向分子对接技术在蛋白靶点预测、作用机制阐明、中药质量标志物筛选及反向筛选技术的组合应用等方面综述其研究进展，以期为中药复杂成分的现代化研究提供理论依据，并讨论其优点和局限性。

1 反向对接在蛋白靶点预测中的应用

中药具有化学成分多样性和活性多样性的特性，复杂的化学成分的协同作用使其作用靶点同样具有复杂性和多样性。因此，中药预防和治疗疾病的机制十分复杂，活性成分靶点的确认和表征具有重要意义[5]。对于植物治疗学来说，寻找生物活性成分的分子靶点非常困难，而利用传统的蛋白质组学分析和药代动力学方法进行搜索又耗时费力[6-8]。采用虚拟筛选和其他计算方法预测分子靶点近年来成为热点，在中药的复杂活性成分研究上发挥了较好的作用。

单味中药活性成分靶点预测的主要流程为：先确定活性成分的化学结构，随后通过各大靶点数据库进行反向筛选，最后对得分较高的结果进行分析。吴晓敏等[9]将龙须藤的两种多甲氧基黄酮TMFA和PMFA作为研究对象，使用Pharm Mapper Server药效团数据库进行反向对接筛选，根据匹配结果进行打分，并按分数由高到低排序，然后选取有统计学意义的潜在靶点进一步分析，根据龙须藤的主要功效对其蛋白靶点涉及的疾病进行分类，发现DHODH和CTSK两个靶蛋白是其治疗类风湿性关节炎的相关靶点；同时筛选出了一些与心血管疾病和癌症相关的蛋白靶点。而国内尚未发现关于这两种成分对于心血管疾病及癌症方面治疗研究报道，这为龙须藤治疗心血管疾病和癌症的相关药理研究提供了启示。最后，结合其他生物信息学手段进行分析，初步预测了这两种成分抗类风湿关节炎的作用通路，为龙须藤治疗该疾病的分子机制提供了理论依据。人参属药材主要成分是人参皂苷（三萜皂苷），具有多种活性，但不同的人参皂苷的靶点亟待明确。PARK K等[10]以潜在药物靶点数据库（PDTD）为基础，选取其中的治疗性条目、添加激酶靶点和73个涉及20种与毒副作用相关的蛋白质构建靶标数据库，结合Glide反向对接软件对26种人参皂苷进行反向筛选，然后对筛选出的靶蛋白与人参皂苷进行相互作用分析。通过对人参皂苷与天然配体结合能的比较和对接结果进行聚类分析，发现了4种潜在的人参皂苷靶蛋白[按其相互作用强弱排列分别为丝裂原活化蛋白激酶1（MEK1）、表皮生长因子受体（EGFR）、丝氨酸蛋白酶凝血酶和丝氨酸蛋白酶α凝血酶]和4个可能的副作用和毒性相关的靶点：乙酰胆碱酯酶，肠脂肪酸结合蛋白，Ⅱ和Ⅳ型碳酸酐酶，谷氨酸脱氢酶。BYLER K G等[11]以sc-PDB数据库中的16 034个蛋白质靶点为潜在的药物靶蛋白库，编写了一个python脚本对乳香二萜和三萜使用Molegro Virtual Docker分子对接软件进行批量反向对接研究。结果显示乳香二萜类化合物与乙酰胆碱酯酶、几种细菌靶蛋白和HIV-1逆转录酶呈选择性对接。通过对靶蛋白及其相互作用进行分析可知：乳香萜类化合物的优先对接符合乳香的传统用途和已有的生物活性。丹参具有活血化瘀的功效，活性成分多种多样，其中丹参醇A研究较少。陈少军等[12]使用PharmMapper Server数据库对丹参的活性化学成分丹参醇A进行反向筛选，预测其潜在作用靶点，根据Fit score由高到低的顺序筛选出与疾病相关的前10个靶蛋白，对排名前3的靶蛋白即视黄醇结合蛋白4、醛糖还原酶和转甲状腺素运载蛋白进行了丹参醇A与靶蛋白药效团匹配特征分析，并对丹参与这些靶蛋白的相互作用进行文献研究，将可能性极大的靶点进行反向分子对接方法学验证和正向分子对接验证，验证了方法的可行性和结果的可靠性，最后预测醛糖还原酶可能是丹参醇A的潜在靶蛋白之一。银杏酸（GAs）为银杏果实“白果”中的有毒成分。YU P等[13]以sc-PDB数据库（version2013）中的9 283个蛋白质靶点为潜在的药物靶蛋白库，将5种GAs与其进行反向对接，结合The Database for Annotation Visualization and Integrated Discovery（DAVID）数据库构建“活性化学成分-靶点-作用通路”筛选得到4个有效的靶蛋白[过氧化物酶体增殖物活化受体（PPARA、PPARD和PPARG）和二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）]，并通过分子动力学（MD）模拟和MM/GBSA计算，证实了以上5种GAs都可以与DHODH在热力学上紧密结合，可作为对抗白血病（AML）的治疗剂或开发天然DHODH抑制剂的先导化合物。

反向对接技术不仅可以应用于单味中药活性成分的靶点预测，还可以对中药复方的活性成分靶点进行预测，从而为阐明中药复方防治疾病的作用机制提供理论依据。如QIANG W J等[14]利用数据库和文献资料，建立了远志散化学成分数据库，通过反向分子对接预测潜在的靶点，构建了组分靶网络，对阿尔茨海默病（AD）的靶网络进行映射和分析，得到“活性成分AD靶”网络。通过网络分析筛选出关键目标，确定了3个关键靶点（COX-2、M-AChRM1和M-AChRM2）和1个重要靶点[乙酰胆碱酯酶（AchE）]。施学丽等[15]基于经方的“方证相应”理论，采用PharmMapper Server数据库对桂枝汤相关活性化学成分进行反向筛选，根据匹配结果进行评分和排序，筛选出与桂枝汤调和营卫作用相关的潜在作用靶点，然后利用AutoDock Vina软件进行正向分子对接模拟试验，验证匹配结果的可靠性，最后动物实验的结果显示桂枝汤调和营卫的作用机制与11β-HSD1有一定的相关性。这种以“方”的药物活性成分为研究的出发点，使用反向分子对接技术寻找“方”所含活性化学成分的蛋白靶点，然后以动物实验来进一步研究这些蛋白靶点与“证”的相关性，通过分析靶点蛋白在生物体内的活性作用来反推“证”的内在发生机制的研究方法也是一条较好的中药复方研究途径。

2 反向对接在阐明作用机制中的应用

对于中药作用机制的阐明，反向对接技术发挥了不可忽视的作用。目前，反向对接技术对中药活性成分作用机制的研究主要集中于抗炎作用机制、抗肿瘤作用机制等方面。有两种主要的研究方法，一种是对炎症通路上的蛋白靶点进行反向分子对接模拟或运用药效团数据库进行反向分子对接筛选，根据对接的小分子化合物与生物大分子结合的自由能由低到高进行排序。而活性化合物与靶蛋白的亲和力高低是由自由能的量值所评价的，对接自由能越高，其亲和力就越低，以此筛选出亲和力较高的靶蛋白，并对其配体-蛋白分子复合物进行作用力分析。如徐佑东等[16]将大黄酸作为实验研究对象，选取TLR4/NF-κB、P38、JAK2/STAT3 3条炎症通路上的30个蛋白为靶标库，运用AutoDock对大黄酸进行反向分子对接实验，依据对接自由能由低到高进行排序，然后对分子复合物中亲和力较高的靶标蛋白进行筛选，获得3个具有高亲和性的靶蛋白（P38、P13Kγ和JAK2），通过分析这3个靶蛋白在炎症通路上的作用，认为大黄酸发挥抗炎作用是通过抑制炎症通路上的靶蛋白，进而影响炎症信号传递。独脚金内酯近年被证明为一种植物中普遍存在的新型植物激素，具有多种生物活性。陈奕锐等[17]根据靶点蛋白数据库构建原则，从NF-κB炎症通路中选取了信号通路上的62个蛋白，使用PDB数据库下载相关蛋白晶体结构的PDB格式，构建靶标蛋白数据库，通过AutoDock Vina分子对接软件，运用MS-DOS批处理脚本，将独脚金内酯类似物GR24和靶点数据库中的靶标蛋白进行反向分子对接实验，最后以对接评分和对接构象的相互作用力分析为依据，反向筛选出3个亲和力较高的靶标蛋白（PARP1、CK2和AKT）。结果表明GR24对这些靶蛋白具有竞争抑制的活性，这也为其抗炎作用机制的研究提供了指引。虽然对于这些药物的研究出发点都是以其抗炎活性为基础，但是最终结果却都显示了其抗肿瘤活性，因此也为其抗肿瘤活性的后续研究提供了参考。槲皮素广泛存在于各种植物中，是天然的黄酮类化合物。张明波等[18]利用AutoDock Vina软件将槲皮素与已知结构的抗肿瘤药物的靶蛋白进行半柔性对接，并对槲皮素与靶蛋白分子复合物的结构氢键相互作用进行作用模式分析，按照其自由能由低到高选取-9.0 kcal/mol以下的靶蛋白，通过计算得到槲皮素对这些靶蛋白的抑制常数都达到了nmol/L级。这表明槲皮素与这些抗肿瘤靶蛋白具有较好的亲和性，槲皮素的抗肿瘤作用是通过抑制二氢叶酸还原酶、二氢乳清酸脱氢酶和基质金属蛋白酶-8等酶的活性来实现的。

犀角地黄汤的化学成分复杂，欧海亚等[19]将筛选出的活性成分用PharmMapper Sever进行药效团匹配反向筛选，使用Cytoscape软件和String数据库分别构建“化合物-靶点-疾病”相关网络和靶蛋白相对应基因的“蛋白互作”网络，最后通过GO-BP功能富集及KEGG通路富集，对靶点蛋白的生物学过程和通路进行分析，揭示了犀角地黄汤治疗疾病的可能作用及机制。中药单体臭椿酮具有多种药理活性，如抗疟疾、抗病毒、抗肿瘤等。赵松峰等[20]使用PharmMapper数据库筛选臭椿酮抗肿瘤的潜在作用靶点，利用KEGG数据库获取筛选出的潜在活性靶点的通路信息，并对其进行富集分析构建共表达网络，最后使用Cytoscape软件构建“化合物（臭椿酮）-蛋白靶点-作用通路-疾病”网络图，通过对其相关蛋白靶标和通路研究，发现这些靶点和通路主要集中于一些肿瘤通路。臭椿酮发挥抗肿瘤作用也是由于其对相关的信号通路的作用实现的，这些理论基础为臭椿酮能够作为治疗多种肿瘤的潜在药物提供了支撑。

3 反向对接在中药活性化合物筛选中的应用

单味中药或是复方都含有大量化合物，这给活性化合物确证带来了难度。反向对接能对大量化合物进行筛选，从中选出有效的活性化合物。如苏博源等[21]以凹叶木兰和中缅木莲中所提取的18种化合物为研究对象，使用Discovery Studio软件中的Pharma DB药效团数据库为靶标数据库进行靶标匹配，根据实验目的去掉未与抗肿瘤靶标结合的化合物，进一步筛选出25组配体-受体的结合类型并对其进行全柔性对接分析和预测剩余化合物的药代动力学与毒理性质。研究结果表明其中4种化合物具有较大抗肿瘤活性潜力。肿节风含挥发油、酯类、酚类、鞣质、黄酮等化学成分。林彤等[22]通过TCMSP等数据库搜集肿节风的化学成分，应用CTD匹配靶点对应的疾病，采用Cytoscape构建和分析网络，利用STRING进行靶点蛋白质相互作用（PPI）分析，通过Glue GO进行基因本体（GO）及KEGG通路富集分析，采用EMDOCK进行分子对接，最终筛选出22个肿节风活性成分，可作用于116个靶点治疗18类疾病，确认了淫羊藿素、苯二甲酸等8种活性成分为肿节风的主要药效物质基础，ALB、EGFR、CASP3及MAPK8等为其关键靶点。

4 反向对接在中药质量标志物筛选中的应用

2016年，刘昌孝院士提出中药质量标志物（Q-marker）这一新概念后[23]，中药质量标志物成为了中药质量标准研究的前沿与核心，业内学者对中药质量标志物的研究方法、研究模式和示范性研究等方面进行了广泛的研究[24-27]。白钢等[28]以中药质量标志物为切入点，尝试构建中药材品质的近红外智能评价体系；李小锦等[29]提出了以临床药效为基准，建立质量标准体系的中药质量生物标志物研究策略；侯小涛等[30]基于中药一物多效的特点，以中药相反功效的物质基础研究为起点，对具有反向功效差异特点的中药进行中药质量标志物研究。而白钢等[28]关于成分与药效关联研究的阐述，又为反向虚拟筛选技术应用于中药质量标志物的研究提供了思路。李小锦等[29]提到采用反向分子对接与网络药理学相结合的方法对中药质量标志物进行预测，这一思路和白钢等[28]关于成分与药效关联研究的阐述相互印证。具体研究是通过文献检索对中英文文献中与研究对象相关的活性成分进行筛选，然后利用PharmMapper药效团数据库进行反向找靶，预测所搜集的中药活性成分直接作用的靶点。对筛选出来的靶蛋白进行功能注释，再根据靶蛋白功能对相应的活性成分进行分组，将所分得的化学物质组与药效进行关联性研究，筛选出与药物关键功能相关的直接作用靶点。最后，将获取的靶点蛋白信息导入DAVID数据库中，通过KEGG-Pathway功能预测靶蛋白的作用通路，对通路进行富集、注释和分析，并构建“药材-活性化合物-靶点-通路-疾病”作用网络，初步预测质量生物标志物的范围后，针对所筛选的关键药理作用进行动物模型验证实验，经过分组、造模、给药后对动物的脂肪组织和肌肉组织中相关蛋白表达进行测定与分析，初步得到药物药效功能相关的质量标志物。

5 反向对接与其他方法组合应用

计算机辅助药物筛选方法和传统药物筛选过程对比，可以避免传统方法筛选的盲目性，具有较好的主观性和高效便捷的特性。近年来，反向分子对接组合其他方法进行目标预测的趋势缓慢上升，尤其是使用反向对接系统和反向药效团映射的反向筛选方法变得非常重要[31]。主要有以下3种组合方法。

5.1反向药效团匹配和正向分子对接方法 综合反向筛选与正向对接的结果，可以更精确、更严密地确定潜在靶点。周域等[32]运用PharmMapper药效团数据库对苍术酮进行反向筛选，按照苍术酮与药效团的契合程度进行评分。将评分排在前10的靶标蛋白的生理作用进行分析，对具有疾病治疗价值的前3个靶标蛋白与苍术酮的药效团匹配特征进行详细描述，最后对3个靶蛋白进一步进行正向分子对接验证。反向筛选和正向对接的结果可预测到细胞维甲酸结合蛋白2、二肽基肽酶Ⅳ和维甲酸β受体是苍术酮的潜在蛋白靶点。

5.2 双重虚拟筛选法 筛选逻辑由算法组成，单一筛选体系可能出现错误或遗漏，多个筛选系统结合使用，可使筛选结果更加可靠。BHATTACHARJEE B等[5]在寻找潜在靶点的过程中，采用基于idTarget和PharMapper的双重虚拟筛选系统，从2个独立的反向筛选平台上获得一组与多种癌症相关的靶蛋白，并根据拟合得分和结合能进行排序，确认了靶点并揭示了其抗肿瘤作用机理。最后，通过对藏红花苦素与Hsp90α在AutoDock中的对接后结合模式进行分析，验证了结果的有效性。

5.3 反向筛选与传统分子/细胞生物学结合 传统分子/细胞生物学技术拥多种优势，与反向对接技术结合，可使预测结果更加可信。CAI J H等[33]提出反向对接结合生物检测和结构生物学的方法，以抗幽门螺杆菌筛选中发现的活性天然产物为探针，采用反向对接法搜索内部潜在药物靶点数据库（PDTD），然后进行同源性研究和酶法检测。结果表明抗幽门螺杆菌肽去甲酰化酶（HpPDF）是筛选新的抗H.pylori药物的潜在靶点。利用上述方法，对于小分子化合物的靶标筛选来说，无疑提高了其匹配的准确性和加强了结果的可靠性。

5.4 反向对接技术与网络药理学结合应用 反向分子对接技术结合网络药理学研究从整体出发通过多成分、多靶标、多途径的研究模式构建“成分-靶点-通路-疾病”关系图，可反映中药作用机理，充分体现了中医用药的整体性，无论是在单方还是复方作用机制的研究都有较为广泛的应用。如汪艳平等[34]通过PharmMapper药效团数据库反向筛选出瑶药四方藤的潜在作用靶点，运用DAVID数据库中的KEGG-Pathway功能，根据潜在的靶蛋白落在通路上的数量预测其作用的信号传递通路，并构建“药材（四方藤）-活性化学成分-靶点-作用通路”网络图，通过对四方藤主要作用通路的分析，发现了与其抗炎作用相关的4条途径，提示四方藤抗类风湿关节炎的作用机制可能是其活性成分通过干扰体内炎症通路，进而影响炎症介质的产生，达到治疗效果的。

6 讨 论

反向分子对接技术在药物的研究与开发领域具有减少成本、节约时间和提高研发成功率等优势，这为筛选药物潜在作用靶点，探索作用机制，以及预测中药质量标志物、活性分子等方面提供了新思路，是研究中药复杂体系物质基础和作用机制的重要方法之一。尽管反向对接技术具有一定的可靠性，但计算机模拟对接的结果不能完全代替体内实验，同时还存在一些缺点，如各类软件的运算方法不同，其结果均存在一定比例的假阳性；另外，蛋白质数据库数据不完整，蛋白晶体结构解析进展缓慢都会使得结果不够完整和准确；最后，评价方法的不够完善，最终结果还需要与其他实验方法的结果相结合进行进一步分析，以及通过体内外研究对目前已鉴定的靶点进行生物学实验验证。因此，面对着中药单一成分多靶点，组方更是复杂多变的特性，反向分子对接技术显示出了很大的优势，在中药活性化学成分蛋白靶点的预测、作用机制的深入研究及功效和生物质量标志物的确定上具有很大的发展空间。如能在蛋白数据库的扩容、对接软件和解析功能的优化、评价体系的发展等方面不断完善，随着反向分子对接理论和技术上的不断完善，反向分子对接技术必将为科学、高效地阐明中药活性分子及其作用途径提供有力工具。