非洲猪瘟病毒的侵染机制及疫苗研究进展

牟 豪，赵光夫，余远迪，许国洋，杨 柳*

(1.重庆市畜牧科学院，重庆 荣昌 402460；2.四川大学 生命科学学院，四川 成都 610064;3.重庆市兽用生物制品工程技术研究中心,重庆 荣昌 402460)

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)属于双链DNA病毒，基因组为170～193 kb，无内含子，共编码150～167个病毒蛋白。ASFV是一种对于养猪业危害极其严重的病毒，具有高致死性和强传染性的特点，每年该病对世界养猪业造成了数十亿美元的经济损失。在我国，ASFV属于一类动物疫病，同时在国际上也属于世界动物卫生组织(OIE)管制检测疫病类型。ASFV的宿主特异性比较强，主要感染猪，包括家猪和野猪，不能感染人类，故不属于人畜共患病。该病毒在临床上可引起肺水肿、发烧、皮肤发绀、脏器黏膜出血等症状，其高毒力毒株能在短时间内导致猪的发病死亡，病死率高达100%[1]。遗憾的是，尽管ASFV的疫苗研究已有几十年的时间，但目前市面上尚无针对ASFV保护性很强的商用疫苗，使得ASFV的防范工作难度进一步加大[2-4]。我国于2018年8月首次向OIE上报了ASFV疫情[5]，且至今仍存在散发疫情。因此，了解ASFV的侵染机制以及疫苗研究进展对于未来控制ASFV疫情具有重要的意义。

1 ASFV浸染细胞方式及胞内转运

1.1 ASFV浸染细胞方式ASFV进入细胞的过程非常复杂，可以通过多种机制侵染细胞，同时取决于多种因素，包括温度、胆固醇、能量和pH，以及需要依赖多个细胞因子[6]。ASFV拥有强大的细胞感染能力，当病毒感染复数为50～80时，只需要30 min就可以浸染高达60%的Vero细胞[7]。

前期研究认为，ASFV是通过受体介导的内吞途径进入细胞，并能短暂寄宿于内吞体。一旦内吞体内环境pH降低到一定程度，ASFV便会穿透内吞体进入细胞质中[8]。随后研究证实，ASFV进入细胞的内吞途径主要由网格蛋白介导(clartin mediated)和发动蛋白介导(dynamin mediated)。相较于其他内吞方式而言，网格蛋白介导的吞噬作用是效率最高的胞内外物质交换方式。通过网格蛋白介导的吞噬作用，ASFV可以在几秒钟以内进入细胞，并且在1～15 min 就能在内吞体中检测到ASFV病毒颗粒[9]。发动蛋白是一种GTP酶，其能在细胞内膜的小窝中发生聚集，并通过水解GTP的方式调节自身发生收缩，进而导致细胞膜发生凹陷，最后再剪切质膜并形成吞噬小泡，而胞外物质可以通过凹陷处被吞噬进入细胞。相应地，使用发动蛋白抑制剂能在体外显著性地限制ASFV对靶细胞的感染[9]。

除了依赖吞噬途径进入细胞外，ASFV也能通过大胞饮的方式进入细胞。据报道，有一大部分ASFV是通过大胞饮进入到巨噬细胞，且使用大胞饮的抑制剂处理之后能够显著性降低ASFV进入巨噬细胞的能力[6,10]。从机制上来讲，大胞饮的产生依赖于细胞膜局部的不稳定性，暗示ASFV能够降低细胞膜局部结构的稳定性，从而通过大胞饮来进入细胞。

值得注意的是，已发表的研究结果多是通过使用内吞抑制剂来研究ASFV侵染细胞的机制，但内吞抑制剂均存在较为严重的非特异性的问题，比如氯丙嗪在抑制网格蛋白介导内吞的同时也会对大胞饮产生抑制作用[11]。此外，不同研究者在研究ASFV侵染细胞的机制时所采用的受体细胞也存在差异。因此，目前不能简单地认为ASFV是依赖于某一种或一类内吞途径侵染细胞，未来需要采用更新更准确的方法来进行相关研究。

1.2 ASFV 胞内转运ASFV一旦经过内吞途径进入细胞后，会沿着内吞途径寄宿于早期内吞体(early endosome)、晚期内吞体(late endosome)，最后到溶酶体(lysosome)[6]。

CUESTA-GEIJO等[9]发现，ASFV仅需要1～15 min 就能从胞外通过吞噬作用进入Vero细胞的早期内吞体中，并检测到ASFV的衣壳层关键蛋白p72。早期内吞体形成后会随着内吞途径进一步形成晚期内吞体，而早期内吞体和晚期内吞体的表面标记有着明显差异：早期内吞体的表面标记主要是EEA1，而晚期内吞体的表面标记主要是RAB7或CD63。另外，早期内吞体转化为晚期内吞体的过程中，其囊泡膜上的v-ATPase泵会将胞质中的H+离子泵入囊泡内引起囊泡内环境酸化。早期内吞体转化为晚期内吞体过程中，随着内吞体内环境pH的降低，ASFV会发生脱壳效应，此时，在光电子显微镜下不能观察到其二十面体的形态特征，但如果使用抗ASFV核心蛋白的抗体检测仍然能够检测到ASFV[6,12]。进一步研究发现，使用v-ATPase的抑制剂可以显著抑制ASFV在细胞质中的复制，并且能够在晚期内吞体中观察到大量的带有完整衣壳的ASFV[13]。这一现象也说明，ASFV感染依赖于内吞体内环境的酸化所导致的ASFV脱壳效应。

ASFV发生脱壳效应之后，会将自己的内核膜与内吞体膜融合，释放核心组分进入细胞质中发生复制。这一个过程是依赖ASFV内膜层上的一个穿膜多肽pE248R蛋白来完成的[6]。此外，研究也发现ASFV会促进整个内吞过程，使内吞体累积在细胞核周围的ASFV “病毒工厂”附近，利用内吞体内的胆固醇和膜上磷脂酰肌醇(phosphoinositides)为ASFV的膜融合以及ASFV的复制提供原料[14]。最新的研究表明，ASFV感染后还会导致细胞内胆固醇向“病毒工厂”富集，而细胞膜上负责运输胆固醇脂类转运体包括羟固醇绑定蛋白(oxysterol-binding protein，OSBP)和胆固醇绑定蛋白(OSBP-related proteins，ORP)介导了该过程。使用OSBP抑制剂伊曲康唑(itraconazole，ITZ)处理细胞后，能够在不影响OSBP定位的情况下显著抑制ASFV的复制[15]。考虑到脂类的转运可能对ASFV的膜融合和病毒复制起到至关重要的作用，那么阻止“病毒工厂”所需要的脂类转运可能会极大地限制ASFV感染。据报道，在其他病毒(如丙型肝炎病毒)感染过程中，通过抑制其脂类运输过程能够显著限制其感染[16]。

2 ASFV疫苗的研究现状

早在1950年就有报道，ASFV感染康复后的猪能够抵御相同毒力ASFV的感染[17]，意味着ASFV疫苗研发拥有良好的前景，但由于种种原因直到现在都还没有一个成熟可用的ASFV疫苗。限制ASFV疫苗发展的一个重要因素是ASFV具有强大的免疫逃逸能力，包括先天性免疫和适应性免疫。例如：ASFV的CD2v蛋白能够抑制淋巴细胞的增殖，促进病毒的感染；A238L基因能够抑制NF-κB和NEAT的激活，同时抑制一氧化氮的释放[18]；MGF360和MGF530/505基因能够抑制Ⅰ型干扰素等一系列炎性因子的释放，提升感染细胞的存活能力[19]。即便如此，在过去几十年里，研究者在ASFV疫苗领域仍取得了一定的进展。目前，针对ASFV开发的疫苗类型主要分为3种：灭活疫苗、弱毒疫苗和基因工程亚单位疫苗。

2.1 ASFV灭活疫苗灭活疫苗是最常见的疫苗类型，已有多种感染性疾病通过灭活苗得到了有效的控制[20]。但是，灭活疫苗往往对于某些复杂的病毒起不到保护作用。前期有研究通过给猪群免疫经灭活的ASFV感染的巨噬细胞和灭活的ASFV，发现并不能给猪提供有效保护[21]。2014年，BLOME等[22]将灭活的ASFV与不同免疫佐剂混合免疫猪群，发现该灭活疫苗同样不能给猪群提供有效的保护。从目前看来，ASFV灭活疫苗的方式可能成功率不高。其原因可能是，ASFV在体内感染过程中表达的蛋白谱和体外培养条件下表达的蛋白谱差异很大，灭活疫苗不能产生足够的保护性抗体。

2.2 ASFV弱毒疫苗弱毒疫苗是通过病毒或细菌在体外或非宿主动物体内的连续传代制成。弱毒疫苗与灭活疫苗相比，弱毒疫苗能够持续性诱导机体免疫系统产生保护性抗体。不少研究者也尝试通过给猪群免疫自然获得的弱毒ASFV或体外致弱的ASFV，但其效果并不理想，免疫猪群往往出现严重的不良反应[23]，原因可能是弱毒疫苗依然是活病毒。此外，研究者发现，通过感染非敏感性细胞(如：Vero细胞)致弱后的ASFV毒株在猪群体内复制的能力显著性下降，毒力基因的表达也同时下降，导致动物不能产生足够强的免疫反应[24]。随着对ASFV病原学的深入研究，鉴定出了越来越多的ASFV毒力相关基因，与此同时，出现了一些基因缺失弱毒疫苗。与传统的自然选择或体外选择弱毒疫苗相比，基因缺失弱毒疫苗是基于ASFV病原学进行的定向突变，其蛋白质组信息更加清晰，安全性与可靠性也更高。已经有一些基因缺失弱毒疫苗在试验中对猪群起到了较好的保护作用。比如，GALLARDO等[25]报道，缺失了A224L和EP153R基因的NH/P68ΔA224L和NH/P68ΔEP153R弱毒苗能够保护猪群对同源ASFV毒株的感染；以及缺失MGF360基因的BeninΔMGF弱毒苗免疫猪群后能够对强毒株产生免疫保护效果[26]。以及近日CHEN等[27]报道，1株缺失了7个基因的弱毒疫苗株HLJ/18-7GD，免疫SPF猪、商品猪以及妊娠母猪后可以产生非常好的保护作用，这可能是一种安全有效的疫苗，有望在控制ASFV传播方面发挥重要作用。2020年6月10日，农业农村部新闻办公室发布了哈尔滨兽医研究所自主研发的1株基因缺失疫苗环境释放和临床试验进展顺利的相关消息。该疫苗是于2020年3月获农业农村部兽用生物制品临床试验批件，按照临床试验方案，于2020年4月上旬、5月上旬和6月上旬分别在黑龙江、河南和新疆等3个基地启动疫苗临床试验。截止6月底，该疫苗株环境释放试验表明疫苗接种仔猪生长状态良好，无异常临床状况；疫苗接种母猪状态良好，无异常临床表现，无异常发情、无流产；免疫猪无疫苗毒排放，无水平传播；免疫后大部分母猪已产仔，免疫组与对照组产仔、死胎率无显著性差异，仔猪生长状况良好。总的来说，弱毒疫苗，尤其是基因缺失弱毒疫苗给ASFV的防制带来了希望。

2.3 ASFV亚单位疫苗亚单位疫苗是通过化学或生物手段，选取细菌或病毒具有免疫保护活性的蛋白或核酸所制成的疫苗，因此被认为是最安全的疫苗类型。ASFV病原学的研究揭示了不少关于ASFV黏附和进入细胞过程中的关键蛋白，如p30、p54、pp220、pp62、p72和CD2v等，这些关键蛋白均可以作为ASFV亚单位疫苗的候选靶点[28-29]。据报道，利用杆状病毒表达的p54、p30和p72蛋白作为亚单位疫苗对猪群进行免疫，其产生的中和性抗体能给猪群提供部分保护作用[30-21]。另据报道，通过对猪群免疫p54和p30的融合蛋白，发现其能诱导产生具有保护性的体液免疫[32]。但是，也有报道称同样使用杆状病毒表达ASFV的p22、p30、p54和p72蛋白免疫猪群后，发现并不能提供足够的免疫保护作用[33]。这看似矛盾的结果可能是因为试验设计的不同，并不能因此直接否认ASFV亚单位疫苗的价值。

2.4 ASFV基因疫苗CD8阳性T细胞在抗体介导的免疫反应中起到了举足轻重的作用，所以ASFV的DNA疫苗也成为一个热门的研究领域。DNA疫苗与亚单位蛋白疫苗不同，DNA疫苗能诱导宿主细胞从细胞内表达病毒蛋白，能直接通过MHC-Ⅰ分子呈递给CD8阳性T细胞进行识别，从而进一步激活后天免疫流程[34]。LACASTA等[35]通过将ASFV的开放阅读框(ORFs)文库和泛素共表达来作为DNA疫苗免疫猪群，发现可以为猪群提供有效的免疫保护，其保护机制可能包括诱导CD8阳性T细胞介导的体液免疫，并且筛选到了多个保护性抗原。鉴于有些蛋白或肽段并不能稳定的诱导保护性抗体的产生，已经有很多研究人员将病毒DNA和蛋白共表达来作为一种新型DNA疫苗。但遗憾的是，将ASFV的DNA(CD2v、p72、p32、±p17)和蛋白(p15、p35、p54、±p17)作为DNA疫苗免疫猪群并不能产生保护性免疫反应[36]。

总之，目前已经发现了超过55个具有免疫原性的ASFV蛋白和44个ASFV新的病毒多肽[37-38]。但是，还不清楚这些蛋白或多肽是否具有完整的免疫保护性。目前，亚单位疫苗研究中，需要找到一个稳定的抗原靶标，同时也需要进一步发现更多具有免疫原性的蛋白。尽管现在亚单位疫苗仅能诱导出部分免疫保护作用，还不能作为真正的疫苗使用，但依赖着它具有高安全性等优点，在该领域的进一步研究是极具意义的。

近年来，重组病毒载体疫苗作为一种新型的基因工程疫苗受到了广泛的关注。目前，有研究团队用重组病毒载体表达多个ASFV抗原来免疫猪群，尽管攻毒免疫猪群依然会出现了感染症状，但免疫猪群血液和淋巴组织载毒量较正常猪群发生了显著性下调[38]。在我国，张会雷等[39]将ASFV的结构蛋白p72和p54或CD2v和p30的基因分别插入到痘苗基因组中，构建了同时表达p72和p54的重组痘苗病毒以及同时表达CD2v和p30的重组痘苗病毒，为ASFV重组病毒载体疫苗研发奠定了前期基础。

3 小结与展望

尽管ASFV现在在我国的流行得到了一定的控制，但想要从根本上控制或清除该病毒还需要很长时间的努力。疫苗作为控制流行病的有效武器，在控制和净化ASFV的工作中将扮演重要角色。想要制作出保护性良好的疫苗，必然需要病原学的深入研究作为基础。在疫苗研究方面，亚单位疫苗有着便利性和安全性高等特点，但是目前看来，也许基因缺失的弱毒疫苗更具有应用前景，而灭活苗可能不适用于作为ASFV的疫苗。新型重组病毒载体疫苗为应对ASFV感染提供了新的研究思路，但是从本课题组对以羊痘病毒为载体的重组病毒疫苗的研究现状来看，受制于病毒的重组效率低以及重组毒株的筛选难度大，重组病毒载体疫苗的研发及应用可能面临极大的挑战。