鲍曼不动杆菌的致病因子和耐药机制

陈肖 王立坤 刘卫东 左志文

1 徐州医科大学药学院，江苏徐州221004；2 临沂市人民医院感控病区，山东临沂276000；3 临沂市人民医院药学部，山东临沂276000；4 临沂市人民医院感染管理部，山东临沂276000

鲍曼不动杆菌（Ab）是不动杆菌属呈单个或成对排列的需氧性革兰阴性球杆菌，无芽孢和鞭毛，有荚膜和菌毛，乳糖发酵试验阴性、氧化酶、动力及硝酸盐还原实验皆为阴性[1]，营养需求低，抵抗力强，可在自然环境中长期存活，具有强黏附性，容易造成危重患者的院内感染，非发酵革兰阴性杆菌中Ab 临床感染仅次于假单胞菌。

多种机制导致细菌耐药率和检出率高居不下， 近年Ab对亚胺培南和美罗培南的耐药率逐年增加。 据报道，2019 年Ab 仅多黏菌素B 和替加环素耐药率较低， 对部分青霉素/酶抑制剂和喹诺酮类耐药率均在70%以上[2]。CHINET 官网数据显示，2019 年全国有11 个省市碳青霉烯类耐药Ab 检出率在73%以上，亟需采取措施遏制Ab 暴发流行的趋势。本文对Ab 的致病因子和耐药机制进行概述。

一、毒力因子

1.膜孔蛋白

外膜孔蛋白调节细胞渗透性， 其中OmpA 是β-桶状蛋白，也是Ab 的主要孔蛋白，和纤连蛋白相互作用并通过菌毛结构黏附并侵袭上皮细胞，释放促凋亡分子诱导细胞凋亡[1]。OmpA 作用于线粒体产生活性氧诱导凋亡或坏死， 可通过MAPK/JNK 通路介导细胞自噬[3]，与宿主补体调节因子结合，阻断补体旁路途径， 使Ab 在血清中繁殖， 逃避免疫清除。Omp33-36 通过激活半胱天冬酶和调节自噬， 活化促凋亡蛋白，激活炎性相关蛋白表达，诱导多种不同细胞类型的细胞凋亡[4]；敲除Omp33-36 基因的菌株，对宿主上皮细胞粘附性和侵袭性大大降低， 也更易被免疫清除。 N1pA 作为Omp22的重要抗原因子， 扩增基因后构建疫苗刺激机体免疫应答，减少小鼠器官和外周血中的细菌数量， 提高小鼠存活率[5]。OprD 是可渗透性孔蛋白，蛋白下调后细菌细胞渗透性下降，OprD 和CarO 蛋白表达降低可影响细菌对碳青霉烯类产生耐药。

2.荚膜多糖和磷脂酶

细菌细胞壁周围包裹整个菌体的黏液样物质， 称为荚膜，主要成分是水和多糖。 荚膜多糖位于细菌最外层保护细菌免受外部威胁，必需基因ptk 和epsA 促进其合成，保护细菌逃避免疫机制，pglC 或pglL 基因负责糖蛋白和荚膜多糖上O-五糖的合成，突变后形成异常的生物膜结构。 荚膜多糖和脂多糖的保守基因簇“K 位点”，其表达受双组分调节系统bfmRS 基因调控[1]，利于细菌在血清和腹水中生长，在组织感染部位存活。荚膜多糖是Ab 产生补体抗性的主要原因，可被认为是Ab 的主要毒力因子， 因为缺失荚膜的Ab 毒性更小，易被补体杀伤[6]。

磷脂酶（PLC、PLD）裂解宿主细胞膜磷脂层，促使细菌侵入宿主细胞，PLD 基因敲除后细菌对血清抵抗力降低， 侵袭上皮细胞能力减弱，还有助于细菌传播至其他组织部位。 有研究筛选出带有PLC 基因的Ab 菌株，和不含有该基因的其他菌株用大蜡螟感染试验和A549 细胞黏附-侵袭试验测试菌株的致病性，结果显示PLC 的存在能增强Ab 菌株的侵袭力和杀伤力[7]。

3.外膜囊泡（OMVs）和青霉素结合蛋白（CBPs）

OMVs 由肽聚糖、磷脂、脂多糖等组成，能向宿主细胞传递OmpA、蛋白酶、磷脂酶等多种物质[1]，而无需细菌与宿主细胞直接接触。 Ab 标准菌株纯化的外膜囊泡以剂量依赖性诱导上皮细胞中促炎细胞因子基因的表达[8]。 高浓度OMVs 对DC 呈明显的细胞毒作用， 而低浓度OMVs 能增强其提呈抗原作用。 外膜囊泡还可以诱导细菌耐药基因的水平转移[9]，表明OMVs 与抗菌药物耐药性的传播有关。

PBPs 参与细菌细胞壁胞质外阶段的肽聚糖生物合成，也是结合β-内酰胺类抗菌药物使其失活的靶点。 低分子量PBP 7/8 的编码基因pbpG 突变后，菌株在人血清和动物模型中生存能力降低， 电镜下观察发现突变株和野生株形态不一，缺失PBP 7/8 影响肽聚糖合成[10]，PBP1A 糖基转移酶[11]参与维持细胞壁稳定性，有助于Ab 的正常细胞分裂。

4.铁摄取

不动杆菌素是Ab 的毒力因子之一， 也是一种混合型铁载体，对铁有很高的亲和力，不动杆菌素生物合成和转运功能受损时显著降低了Ab 标准菌株在上皮细胞的存活能力。entA 是合成不动杆菌素前体2，3-二羟基苯甲酸的重要基因，基因突变后缩短菌株细胞在人肺泡上皮细胞的生存时间，减弱菌株杀灭大蜡螟幼虫的能力[12]。bas 和bar 基因在不动杆菌素基因簇中的位置对不动杆菌素铁载体中铁的获取和吸收也有重要作用。 细菌通过铁离子介导的铁在细胞内的氧化应激反应中起着重要的保护作用。

5.其他

此外Ab 蛋白质分泌系统（T1SS、T2SS、T6SS）分泌效应蛋白作用于靶细胞[13-14]。 T1SS 分泌的蛋白质不易被水解，且可以直接将蛋白质从胞内转移至胞外， 介导Ab 形成生物膜粘附宿主细胞。T2SS 依赖信号肽（sec）转移酶，主要分泌水解酶和毒素并获取营养，增强细菌毒力[14]。 T6SS 分泌多种效应因子杀伤靶细胞和竞争细菌，包括肽聚糖水解酶、脂肪酶、溶血素-联合调节蛋白 （hcp）、 缬氨酸-甘氨酸-精氨酸蛋白G（VgrG）等，总体使细菌黏附侵袭能力增强，提高细菌致病性，并在宿主细胞内适应存活[14-15]。

二、耐药机制

1.产生药物灭活酶

（1）β-内酰胺酶

基于序列同源性可分为A～D 4 类， 其中B 类是金属β-内酰胺酶，主要包括VIM、IMP 等，可水解头孢菌素、碳青霉烯类，不能被β-内酰胺酶抑制，是Ab 对碳青霉烯类耐药的重要机制。 C 类属于头孢菌素酶（AmpC 酶），由染色体介导，是Ab 天然固有，对碳青霉烯类敏感，编码基因blaADC-30、51、53 与AmpC 酶表达菌株耐头孢菌素类机制相关[1]。 D 类β-内 酰 胺 酶 属 于 苯 唑 西 林 水 解 酶 （OXA 酶），OXA-23 和OXA-51 是D 类的主要亚型，Ab 天然携带blaOXA-51， 水解碳青霉烯类活性弱于B 类， 影响细菌包膜通透性和外排泵。OXA-23 存在于质粒或染色体上， 经由整合子和克隆机制在细菌间水平转移而引起广泛耐药传播[16-18]。

上游插入ISAba1 基因能上调A 类超广谱β-内酰胺酶的表达，启动C 类编码基因bla-ADC[19]，使AmpC 酶水平高表达，并对D 类OXA-23 具有协同作用[20]，增强固有基因blaOXA-51 水解碳青霉烯的活性。

（2）氨基糖苷类修饰酶

Ab 通过aacC1、aacC2 和aacA4 编码乙酰化酶、aphA1 和APH（3''）编码磷酸化酶或aadB、aadA1 使酶核苷化使氨基糖苷类抗生素药物结构钝化失活，编码基因一般位于Ⅰ类整合子，常见基因有aphA1、aphA6、aacC2、aacC3、aacA4、ant3n[21]；还产生16S rRNA 甲基化酶（ArmA），保护细菌核糖体30S 亚基结合位点16S rRNA 氨基酰-t R NA，导致产酶菌株对所有氨基糖苷类几乎全部耐药。

2.药物作用靶点结构改变或被保护

除上述提到的ArmA 酶甲基化16S rRNA 使菌株不被氨基糖苷类药物抑制， 喹诺酮类分别编码2 个作用靶点DNA螺旋酶（GyrA2B2）和拓扑异构酶Ⅳ（ParC2E2）部分亚基的gyr A 和parC[1]突变，会引起药物与酶结合能力减弱，并且由质粒介导的qnr 基因可以保护DNA 螺旋酶，导致菌株对喹诺酮类的严重耐药。 青霉素结合蛋白缺失或表达减少使得该细菌对β-内酰胺类耐药，脂多糖被修饰或缺失能降低菌株对多黏菌素的敏感性。

3.减少进入菌体内的药量

（1）外排泵系统

已知的外排泵系统主要包括5 大家族[1]，其中4 个家族都是依赖质子动力势能获得能量。 耐药结节细胞分化家族（RND 家族）中AdeABC、AdeFGH 和AdeIJK 能将氨基糖苷类等多种抗菌药物泵出， 也把溴已定等消毒剂作为底物，导致消毒剂在常规使用浓度下不能抑制或杀灭细菌； 另外AdeFGH 和AdeIJK 分别介导获得性和固有性耐药。 刘献清等[22]分别敲除RND 家族主要外排泵基因并对比敲除前后该菌株对抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC），结果显示adeB 基因对细菌耐药性影响最大。 主要协同转运蛋白超家族（MFS）特异性药物外排泵TetA 和TetB 编码基因引起四环素耐药，CmlA 和CraA 介导氯霉素耐药。 多药及毒性化合物外排家族（MATE 家族） 编码基因AbeM 介导亚胺培南和氟喹诺酮类，小多重耐药家族（SMR 家族）编码基因AbeS，还有其他家族 编 码 基 因 EmrAB -TolC、A1S_1535、A1S_2795、ABAYE_0913 均不同程度对多种抗菌药物耐药，包括奈替米星、妥布霉素、氯霉素等。

（2）外膜通透性

外膜蛋白是革兰阴性菌外膜的主要结构成分，OmpA 是Ab 最主要的膜孔蛋白，也是致病因子之一，在Ab 黏附侵袭、诱导凋亡、形成生物被膜中扮演重要角色，也能帮助细菌免疫逃逸，OmpA 和CarO 能够与OXA-23 碳青霉烯酶相互作用，影响细菌对药物敏感性。 下调CarO、Omp22、Omp33-36、Omp43-44 等孔蛋白的表达和耐碳青霉烯类水平有相关性[3-4]。

（3）生物被膜

生物被膜的形成可导致细菌MIC 高达无被膜细菌的10～1 000 倍[23]，Ab 形成生物被膜受多种因素调控， 菌毛由csuA/BABCDE 基 因 编 码 合 成， 同 时 也 受BfmSR、GacSA、CheA/Y 双组分系统[23-25]和外排泵系统调控，细菌激活群体感应（QS）系统通过Ab 自身分泌自诱导信号分子乙酰高丝氨酸内酯（AHLs），进而促使浮游状态的Ab 转化为生物被膜[26]。细胞外基质黏附包裹细菌、外排泵部分基因[25]在生物被膜细胞中表达增多，基因缺失菌株则生物被膜形成减少、以外膜蛋白为主的外膜囊泡参与黏附上皮细胞[27]、金属离子浓度[1]和碳青霉烯类耐药基因[28]等均可调控生物被膜形成过程。

三、结语

近年来，Ab 耐药株在院内广泛流行，体外联合药敏试验结果良好，但实际应用疗效有限，尤其颅内感染用药选择性较少。 因此，进一步研究Ab 致病性和耐药机制，对寻求突破有重要意义，此外，还应加强Ab 的感控管理，制定相关干预措施控制临床耐药菌株的传播，注重合理应用抗菌药物避免诱导耐药。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突