美国国家禽流感监测计划——第一部分：监测体系概述（三）

译校│翟新验 杜建（中国动物疫病预防控制中心）

王慧强（北京市动物疫病预防控制中心）

一、病例定义

在美国，全面必须报告禽流感（N A I）病例定义包括以下信息：主动和被动监测（国家监测单元），临床和实验室诊断标准，被动和主动观察监测的实质内容就是识别临床症状和大体病变，对可疑病例立即启动进一步调查，并且快速有效地采取适当的防控措施（Kradel等，1986；Weaver等，2006），首发病例，实验室确诊是必不可少的。

1.临床症状描述。临床症状曾在本文件前面介绍过。早期发现可疑的临床病例有利于及时采样，并把样品送至实验室进行检测，以确定发病或死亡是否由AI病毒的毒力毒株引起的。亚洲高致病性禽流感（HPAI）H5N1，具高死亡率和明显的临床症状。由于种类、年龄、性别、并发感染、毒株、饲养环境等因素不同，其他NAI H5/H7亚型毒株感染家禽引起的临床症状和死亡率也会有所不同。家禽的消化、呼吸、神经、生殖或循环系统会受到影响，只有轻微或无临床症状的家禽同样有可能感染H5/H7亚型低致病性禽流感（LPAI）病毒，这种隐性感染只能通过有计划的监测项目检测出来。尽管某些HPAI病毒株和一些LPAI H5/H7亚型毒株不会表现出明显的临床症状，但是下面将要描述的几个临床症状也有可能预示着NAI疫情的发生。鉴于这些特征，被动和主动监测还要结合血清学监测。

2.临床症状定义。除了实验室检测标准，临床症状定义有助于正确诊断存在于商业养殖业、活禽交易市场体系（LBMS），如庭院养殖等非传统家禽饲养系统中的NAI H5/H7亚型病毒。当出现临床症状时，符合临床症状定义通常是启动下一步检测的首要筛查方法。家禽感染NAI H5/H7亚型病毒后一般会出现一种或多种临床症状和大体病变：叫声变小；精神萎靡；结膜炎；产蛋量下降，产浅色蛋、畸形蛋或薄壳蛋；呼吸症状，如出现啰音、尖锐音，呼吸困难；共济失调、歪颈等神经症状；采食和饮水量减少；鸡冠和肉髯肿胀或坏死；头和腿肿胀；腿皮下出血；肺里充满积液和血液；气管炎和气囊炎；器官斑点状出血（Easterday等，1997）；或是禽群出现如下的死亡情况（Weaver等，2006）：

商业鸡：连续两天，每1 0 0 0羽鸡死亡超过4羽；商业蛋鸡：连续两天，死亡数量为正常情况的4倍（2～50周龄蛋鸡日均死亡率0.5/‰，5 0周龄后日均死亡率0.75/‰），或超过3天产蛋率下降5%；商业火鸡：每天每1000羽火鸡死亡超过2羽；庭院养殖家禽：只要出现突发的产蛋量下降或者明显的鸡只死亡时都应予以调查。

依据病毒致病力，混合平养家禽可能会快速传播并死亡，笼养家禽（如蛋鸡、鹌鹑）其死亡进程可能会稍慢，通常超过10～15天（Swayne，2006）。

3.流行病学标准和限定条件。对一个病例定义，首先要明确监测群体，这是首要的标准，监测要限定于某一具有特殊流行病学特征的畜群、禽群或是养殖场所。通过行业、州和联邦政府共同完成对商业、LBMS和庭院养殖禽群的监测。

商业家禽企业监测（包括许多猎鸟养殖场），主要通过国家家禽改良计划（NPIP）项目开展；在全国鸡肉理事会和国家火鸡联盟的倡议下，商业肉鸡和肉火鸡监测也要达到或是高于NPIP商业家禽监测的要求；LBMS监测主要在动植物卫生检疫局（APHIS）和参与州的动物卫生机构共同合作下进行，联邦政府设立的项目是为了加强和统一各个州的项目及辅助各州达到在LBMS预防和控制LPAI H5/H7的目标，各个州的监测计划通常会高于APHIS的最低标准；非传统庭院养殖家禽监测主要是各个州与APHIS合作完成。

4.实验室诊断标准。亚临床感染病例一般都要通过实验室诊断进行确诊，或者通过易感品种禽类的临床症状、病理变化等做出判断的临床病例，需要通过一种或多种实验室诊断方法来确认HPAI和LPAI。将样品接种鸡胚分离病毒，通过检测血凝活性确定A型流感病毒的存在；通过血凝素和神经氨酸酶抑制试验确定是否为H5/H7亚型；采用静脉接种致病指数（IVPI）测定法鉴定是否为HPAI病毒分离株，通过静脉接种4～8周龄鸡，连续观察10天，当IVPI值大于1.2或导致75%以上鸡死亡，则判定该毒株为HPAI病毒株。如果接种鸡只没有死亡；测定血凝素前体蛋白（HA0）裂解位点碱基序列，从而判断病毒是否有突变为高致病性的能力；如果毒株不符合HPAI诊断标准，则可把该毒株定义为LPAI H5/H7亚型病毒。

5.疑似。实时反转录聚合酶链式反应（RRT-PCR）在感染48小时后即可检测到AI病毒（HPAI病毒感染24小时后）（Spackman，2006），以及抗原捕获酶免疫试验（AC-EIA）在感染1～5天后即可检出（Gelb和Ladman，2006）。RRT-PCR方法检测粪便样品（泄殖腔拭子），相较于气管样品病毒分离的敏感性和特异性要低。

6.NAI病例分类。可疑病例：基于临床病例定义做出NAI初步诊断，并经各州的动物卫生官员和APHIS负责当地的兽医会诊；日常监测中，有或无临床症状，但经实验室检测为阳性结果。

疑似病例：满足可疑条件或以下任一判定标准的病例：活禽气管或泄殖腔拭子（或粪便）；死亡禽只粪便或是器官组织混样，器官组织包括气管、肺、气囊、肠、脾、肾、脑、肝和心，接种鸡胚（世界动物卫生组织，2005）。感染7～10天后即可检出抗体，临床症状一旦出现的急性期血清样品和7～28天恢复期血清样品。

“逻辑”一词源于德国哲学家黑格尔，是指事物发展的客观规律。以我国扶贫历史进程为背景，分析和认清土地扶贫的逻辑，是进一步了解赫章县乃至贵州省国土系统扶贫政策，取得扶贫成效，提炼扶贫工作经验，服务全国扶贫工作的重要理论基础。

肛咽拭子或环境样品（LBMS）：经琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）检测出A型流感抗体，但无法解释是否由疫苗造成的；随后通过血凝抑制试验（HI）鉴定H5/H7亚型病毒；经NPIP行政官批准的商品化A型流感抗原检测剂盒检测为阳性，确定为H5/H7亚型病毒（USDA）；通过RRT-PCR检测出A型流感病毒RNA，并确定为H5/H7亚型病毒。

确诊病例：经美国农业部国家兽医实验室（USDA NVSL）分离出A型流感病毒，并鉴定为H5或H7亚型（NAI）病毒，接下来确定其致病性（HPAI或LPAI H5/H7）。

7.报告要求。商业家禽NAI H5/H7感染，应按照APHIS兽医备忘录第580.4项“疑似外来动物疫病/新发动物疫病（FAD/EDI）调查程序”和第565.14项“向OIE和贸易伙伴报告LPAI H5/H7”的要求进行报告。此外，各州的动物卫生官员和APHIS负责当地的兽医共同在场时，州的动物卫生官员按照NAHRS和OIE指南，通过国家动物卫生报告系统（NAHRS）向USDA报告商业养殖场发生的NAI。

二、采样方法

主动的实验室监测包括定期对家禽及其生活环境（如禽舍）等进行采样，检测抗原或抗体的存在。主动的实验室监测主要用于检测没有出现高死亡率的养殖场LPAI H5/H7流行情况，也可检测H5或H7亚型病毒。当家禽中存在抗体时，实验室监测方法是非常敏感的，一般在感染AI病毒7～10天后就可以检测出抗体，几个月后抗体水平下降。这些检测是有价值的，因为在长达几个月内，仍然能检测到抗体。然后，当出现几个毒株混合感染或者是病毒一直在禽群流行时，抗体检测方法就不能区分哪个毒株或者该毒株是否为当前流行毒株。只要病毒仍在禽群中流行，抗原（病毒蛋白）检测方法是敏感的。由于AI病毒排出期通常只有10天左右，所以处于流行阶段时的检测是较为敏感的，但随着AI病毒排出逐渐减少，其抗原检测敏感性也会下降。实验室监测对发现HPAI是有限的，反而通过观察病毒感染家禽所引起的典型而严重的临床症状，更容易发现疫情。

与实验室采样检测相比，采用更主动的观察监视也是监测疫病的有效途径。养殖者的利益和疫病防控效果、生物安全管理措施的执行是息息相关的，按计划要求积极观察生产禽群，从而发现特定的临床症状并向服务人员和兽医人员报告。主动的观察监视和主动的实验室监测一样，都是依据制定的计划安排开展，与实验室主动监测相比，它具有的优势是：更方便经常性地操作，例如在大型商业养殖场每天可以开展1～2次观察监视，对于发现HPAI，这种主动观察监视方式的优势更明显，便于启动进一步调查和实验室采样。几乎所有的大型商业养殖场都可以通过主动观察监视发现多种疫病，包括出现疑似AI病毒感染临床症状的疫病。其他养殖场所，如小规模但高价值的养殖场，庭院养殖户也可以使用主动观察监视的方法，但这一般没有行业标准，也没有切实可行的操作管理程序。

所有各类家禽业都应使用被动监测方法，及时向上报告可疑死亡或临床症状病例。与主动的观察监视不同，这不是一个连续、定期地按计划执行的方法。自愿主动报告病例的情况可能会随着养殖场户、疫病意识、实验室监测成本和禽群死亡率不同而有所不同。

根据国家禽流感监测系统（NAISS）描述的养殖场类型不同而采取不同的监测手段。主动的实验室监测手段（如血清学或病原学检测）多应用于大型商业养殖家禽，LBMS和高风险的候鸟，根据监测目标不同，采用不同的诊断检测方法。

对迁徙中候鸟的主动实验室监测，主要目的是防止亚洲HPAI H5N1传入美国，对候鸟的监测多采用抗原检测方法。

对LBMS中，用于生产的禽群多采用血清学的监测方法；对于在市场上出售存活时间比较短的禽类多采用病原学的监测方法；对市场场所采集环境拭子以检测是否存在活的病毒。对所有病原学监测方法，最终都要确定是否为亚洲HPAI H5N1病毒。

对于大型商业养殖场中HPAI的监测，很大程度上依靠禽群死亡率报告做出判断，在这些病例中，实验室诊断方法的目的不是为了早期发现，而是为了确定是否为HPAI病毒及其亚型。

由于HPAI会导致高死亡率和具有快速传播能力，主动的实验室监测作为监测手段对于早期发现HPAI不是十分有效，除了对候鸟监测/检测HPAI外，USDA采用的主动实验室监测手段主要是用于发现LPAI H5/H7。

根据新的NPIP LPAI H5/H7防控指南，自愿参与者有责任向联邦认可的实验室提供一些检测样品，样品来自不明原因引起的呼吸道疫病、产蛋量下降以及疑似禽流感引起的家禽死亡的病例。诊断监测活动按照NPIP对预防和控制LPAI H5/H7要求进行，是需要向国家兽医部门报告的一种疫病。

血清样品通过ELISA抗体检测方法或AGID方法进行初步筛查；若经ELISA方法检测为阳性样品，则需再次通过AGID进一步确认。确认为阳性样品之后则应进行下列调查，在该阳性样品场重新采样进行病毒分离，并将样品送至USDA NVSL进行亚型鉴定和致病性测定。AI病原学RRT-PCR检测方法用于检测H5和H7亚型，但需要在联邦批准的诊断实验室开展。所有H5或H7亚型病毒都必须进行下一步致病性分析，以鉴定其是否为HPAI病毒株，例如亚洲HPAI H5N1。

主动实验室监测采样主要是由商业养殖者、联邦与州政府之间合作完成，以下将会介绍一些采样要求：不同的家禽业参与者，对其家禽的采样方法会有所不同。例如，不是美国所有的州都有活禽交易市场，不是美国所有的州都有LBMS项目。另外，由于NPIP项目主要是由商业家禽养殖的48个州共同合作建立的，所以不是所有的养殖者都会参与NPIP项目；不同类型的家禽抽样方法都建立在一定国家规定的最低标准基础上（联邦行政法规（CFR），第9卷，第145～147部分）。

每个州的项目都需要达到国家规定的最低标准，但可以选择收集其他的相关数据。这里所描述和分析的只是最低标准；虽然在这些监测计划中对检测方法有规定，但不是每个参与实验室都有权开展所有的检测项目。所以，每个州的检测方案并不是统一的，而是应考虑所在州的实验室能否进行相关实验活动；尽管在一些州LPAI H5/H7检测项目已经获得了通过，但针对商业肉鸡采样计划所用的抗原检测方法（RRT-PCR和ELISA抗原检测方法），还未建立明确的最低标准。一些企业可能会选择符合FSIS要求的方法进行屠宰前检测，从而免去检测成品。这些公司根据采样计划开展抗原筛查，如前CFR第9卷、第146部分，LPAI H5/H7自主控制方案，主要采用抗体检测方法，肉鸡应在屠宰前10天进行抗体检测。

这份文件中没有提及屠宰场监测的作用，因为对这种监测效果进行评定比较困难。然而，事实上几乎所有的肉鸡包括大型、小规模肉鸡养殖场生产的肉鸡都会在屠宰前经FSIS或国家检验机构检测。如果家禽出现明显的呼吸道感染症状，例如气囊炎，依据疫病严重程度决定是否销毁，养殖者被告知每批屠宰家禽损失率。对于高的病变或是销毁情况，行业兽医或服务人员还会对家禽的感染来源进行调查。