一测多评法测定刺五加叶中5个酚类成分含量的研究

关 欣，秦 雯，谢百波，臧新钰，肖坤，张洁

(1.北京城市学院生物医药学部，北京 100094；2.北京慧宝源生物技术股份有限公司，北京 100000；3.辽宁省抚顺市食品检验检测中心，辽宁 抚顺 113000)

中药刺五加叶为五加科植物刺五加叶Acanthopanaxsenticosus(Rupr.et Maxim.)Harms的干燥根和根茎或茎，具有益气健脾、补肾安神的功效。刺五加叶中主要含有皂苷、黄酮以及有机酸等类化合物,具有保护心脑血管系统、抗肿瘤、降血糖等药理作用。研究表明刺五加叶中的多糖具有较强的自由基清除能力，可作为新型天然抗氧化剂进一步开发利用。叶恒等建立HPLC同时定量刺五加叶中原儿茶酸、绿原酸、刺五加苷E、金丝桃苷及槲皮苷五种主要成分的方法。该方法简便可靠,适用于刺五加叶中的多成分含量测定。目前，随着对刺五加成分的不断探索开发，刺五加作为药物和保健品的需求逐年增加,但资源逐渐减少，为扩充刺五加药用资源，经查发现刺五加叶中酚类成分有活性，因此本实验优先研究刺五加叶成分，然而，刺五加叶缺乏统一质量检测标准，难以全面反映药材的整体质量。

本文建立刺五加叶一测多评法实现对刺五加叶5种成分的质量控制，即选择其中使用广泛的绿原酸，建立其与新绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷和槲皮苷间的相对校正因子，计算出各成分的含量，为刺五加叶质量控制提供参考依据。

一、实验材料

(一)实验仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪(配紫外光检测器)，真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，超纯水机(深圳市宏森环保科技有限公司)， SB25-12 DTD超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)。

(二)实验试剂

乙腈为色谱纯，纯净水(购自娃哈哈集团有限公司)，其他试剂均为分析纯，其他如表1、表2。

表1 实验对照品和实验试剂

表2 实验药材

二、方法与结果

(一)色谱条件

色谱柱为Agilent Elipse Plus C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm，5μm)；流动性为0.3%磷酸水(A)-乙腈溶液(B)梯度洗脱，0～3 min， 95%→95%A；3～40 min， 95%→80%A；40～55 min， 80%→70%A；55～60 min，70%→10%A；体积流量1.0 mL/min；检测波长360 nm；柱温30℃。

(二)溶液制备

1.供试品溶液的制备。将刺五加叶干燥后粉碎，精确称取刺五加叶粉末1.0 g，精密加入70%甲醇水10 mL，超声提取40 min，用70%甲醇水补足失重，0.45 μm滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.对照品溶液的制备。精密称取各对照品适量，加甲醇溶解定容配制成每1 mL含绿原酸0.951 mg、隐绿原酸0.502 mg、新绿原酸0.63 mg、槲皮苷1.12 mg、金丝桃苷1.162 mg的溶液，作为对照品溶液。

3.方法学考察

(1)专属性试验。取供试品溶液，采用上述色谱条件进样分析，观察图谱，比较各对照品保留时间，结果表明该方法专属性良好，见图1和图2。

(2)线性关系试验。精密称取各对照品绿原酸9.51 mg、新绿原酸6.3 mg、隐绿原酸5.02 mg、金丝桃苷11.62 mg、槲皮苷1.12 mg，置于10 mL量瓶，用甲醇定容至刻度线，摇匀，配成各对照品储备液。精密量取各对照品储备液适量，加甲醇稀释成系列对照品溶液，新绿原酸为0.2，0.1，0.05，0.025，0.01，0.005 mg/L，绿原酸为0.95，0.8，0.4，0.2，0.1，0.05 mg/L，隐绿原酸为0.2，0.1，0.05，0.025，0.01，0.005mg/L，金丝桃苷为0.8，0.4，0.2，0.1，0.05，0.025(mg/L)，槲皮苷为0.08，0.04，0.02，0.01，0.005，0.0025 (mg/L)。按照2.1色谱条件进行测定，计算得到各对照品线性回归方程，表明在浓度范围内线性关系良好，考察结果见表3。

图1 刺五加叶供试品高效液相色谱图

图2 混标对照品溶液高效液相色谱图

表3 对照品线性范围及线性回归方程

(3)精密度试验。取上述混合对照品溶液，在上述色谱条件下进样6次，每次进样10 μL，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、槲皮苷峰面积的RSD值分别为0.24%、0.03%、0.44%、0.05%、0.16%，结果表明仪器具有良好的精密度。

(4)稳定性试验。将上述供试品溶液放于室温下0、2、4、8、12、24 h，根据上述色谱条件检测其峰面积，考察24 h内供试品溶液的稳定性。24 h内5种成分峰面积的RSD值分别为新绿原酸2.35%、绿原酸0.72%、隐绿原酸2.06%、金丝桃苷0.58%、槲皮苷0.52%(n=6)，表明试验溶液在本实验条件下具有良好的稳定性。

(5)重复性试验。制备6份供试品溶液进样分析，得到各成分的峰面积，计算得到5种目标成分的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷和槲皮苷峰面积的RSD值分别为1.77%、2.02%、2.78%、1.75%、1.30%，结果表明该实验重现性良好。

(6)加样回收率试验。按上述方法制备9份供试品溶液，分别加入样品中5种成分质量的低(80%)、中(100%)、高(120%)浓度已知对照品，根据上述色谱条件进行分析，计算加样回收率及RSD值。结果表明，加入的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、槲皮苷5种成分质量的平均回收率，在低浓度时分别为95.3%、96.2%、97.7%、97.9%、95.8%，RSD值分别为0.8%、1.4%、3.8%、0.5%、1.6%；在中浓度时分别为95.0%、95.6%、103.6%、103.5%、104.6%，RSD值分别为2.5%、2.7%、3.0%、1.7%、1.9%；在高浓度时分别为96.3%、97.9%、96.8%、95.6%、95.4%，RSD值分别为1.3%、5.3%、3.7%、2.3%、0.9%。

(7)定量下限、检测下限。用50%甲醇水稀释混合对照品，根据上述色谱条件重复进样检测6次，实验结果表明在最低定量限检测中，当新绿原酸浓度为0.004mg/mL时信噪比为9.91，当绿原酸浓度为0.004mg/mL时信噪比为12.35，当隐绿原酸浓度为0.004mg/mL时信噪比为9.62，当金丝桃苷浓度为0.008mg/mL时信噪比为6.23，当槲皮苷浓度为0.015mg/mL时信噪比为11.82。在最低检测限检测中，当新绿原酸浓度为0.0008mg/mL时信噪比为3.40，当绿原酸浓度为0.0008mg/mL时信噪比为2.21，当隐绿原酸浓度为0.0008mg/mL时信噪比为3.12，当金丝桃苷浓度为0.0003mg/mL时信噪比为2.87，当槲皮苷浓度为0.0005mg/mL时信噪比为3.60。

4.相对校正因子的确定。根据上述方法制备6份混合对照品溶液，并根据上述色谱条件确定5种成分的峰面积。使用绿原酸作为内参物，计算新绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷槲皮苷的相对校正因子分别为0.906、0.899、3.136、2.645。

5.一测多评法与外标法结果比较。制备6份供试品溶液，按上述色谱条件测定，用两种方法计算各成分的含量，结果见表4。其中，编号1～6批刺五加叶产地依次为辽宁省新宾(刺五加叶)、辽宁省清原(刺五加叶)、黑龙江省鸡西(刺五加老粗叶)、黑龙江省鸡西(刺五加嫩叶)、黑龙江省鸡西(刺五加叶1)、黑龙江省鸡西(刺五加叶2)。分析结果认为2种含量测定方法得到的含量之间无显著性差异，说明一测多评法用于刺五加叶中多种酚类成分的含量测定中可行。

表4 外标法和一测多评法测定刺五加叶中5种成分含量(mg/g)

三、讨论

(一)波长的选择

实验尝试不同的检测波长，发现在360 nm检测波长下，测定成分的分离度良好，峰形较好，杂质峰较少，确保方法的准确度较高。

(二)提取方法的考察

实验尝试甲醇、70%甲醇水、50%甲醇水提取刺五加叶。结果发现使用70%甲醇水超声提取刺五加叶时，目标成分提取率较高，分离度较好，杂质峰较少。而且具有易操作、节省时间、成本的特点，实验建立一测多评法测定刺五加叶中五种酚类成分的含量，为刺五加叶的质量评价和质量控制提供参考。